[求助ROS检测]为什么我的阳性对照和空白对照差不多

x5159991

我的实验是检测LPS刺激RAW，检测ROS变化，做了两次 每次Control和LPS组结果差不多（已验证LPS成功诱导了RAW的极化），但是差距不明显且control组结果也太高，不知道是我分析方法不对还是哪里出了问题，第一次做ROS检测，是在分析不到原因特意请教一下大家，这是我的Blank组（正常细胞，无染色）、Control组（正常细胞、染色）和LPS组（raw+LPS，染色）的图片，请各位老师和同学指教。

wxd

分析ROS这种单峰的流式结果，不要只看阳性比例，还可以看一下平均荧光强度。
ROS是有专门的阳性对照试剂CCCP的，LPS只是你实验的阳性对照组，可能在刺激细胞产生活性氧方面确实不行。
如果没有时间买专门的CCCP，可以试一下1000uM双氧水（药店买的3%的就行，需要稀释）处理Hela细胞6h，再测一下ROS，排除一下试剂的原因。

x5159991

wxd 发表于 2023-5-29 08:49
分析ROS这种单峰的流式结果，不要只看阳性比例，还可以看一下平均荧光强度。
ROS是有专门的阳性对照试剂CCC ...

选择LPS是因为实验的分组就是需要用LPS诱导极化，我比较疑惑的点在是control和blank的差距好大（0~92）lps和control差距很小（92~98）,=如果92-98的差距是因为lps确实不行，那么0-92的差距怎么解释呢？会和我流式仪器的设置等有关吗

niwanmao

如@wxd  站友所说，平均荧光强度更重要，更能反映出差异。另外，不知道实验重复过几次？

wxd

Blank和Control的差异，是染色和不染色的差距。它们之间的差异只是标明荧光探针没有问题。Control组没有经过刺激不代表本身就不会产生活性氧，只是可能会没有经过药物刺激的细胞产生的多。

yxyyjs

首先ROS的阳性比例和平均荧光强度各组都看一下；然后ROS探针孵育、洗脱都结束后，在上机之前，可以试一下样本始终插在冰盒里，虽然说明书上都没有这个么写，但是我自己遇到过常温下十几分钟重复上一次样，ROS水平下降很多，插在冰上，半小时多都信号都不会明显掉下来；最后就是你LPS诱导RAW极化分化是几天，不妨试试6小时之类的时间点后就去测，ROS在LPS作用的当天应该测到明显上升；最后的最后，可以多做几个复孔重复一下，每组留下两三个孔，荧光显微镜下拍个照片看看，佐证一下。

x5159991

niwanmao 发表于 2023-5-29 14:17
如@wxd  站友所说，平均荧光强度更重要，更能反映出差异。另外，不知道实验重复过几次？ ...

第一次做 感觉组间差距过小可能操作上不对 准备找找原因重复

yxyyjs

还有你的RAW264.7本身长得是怎么样啊，是小圆形密集的，还是已经膨大长出两个或更多触角来了，如果对照组已经不是圆圆的小小的，那个这个raw264.7其实就不大适合做极化的实验了，下游很多检测项都不好测出漂亮的结果来

x5159991

yxyyjs 发表于 2023-5-30 11:02
还有你的RAW264.7本身长得是怎么样啊，是小圆形密集的，还是已经膨大长出两个或更多触角来了，如果对照组已 ...

总体还行吧 有一些极化的但是不多 这也是下一步准备调整的项目。

x5159991

yxyyjs 发表于 2023-5-30 11:02
还有你的RAW264.7本身长得是怎么样啊，是小圆形密集的，还是已经膨大长出两个或更多触角来了，如果对照组已 ...

为什么不好做出好看的结果呀，raw应该还挺泛用的，贵组现在用什么细胞替代呢