设计荧光流式多色方案的五步法

niwanmao

一、选择标记

• 要分析什么目标群体，例如效应T细胞和记忆T细胞。
• 定义目标群体的谱系标记物，例如CD3、CD8、CCR7、CD45RA。
• 如需分析功能，则需增加功能性标志物，如PD-1、CTLA-4、CD69。
• 了解标记物的预期抗原密度，例如低、中、高、极高。
• 了解哪些群体会共表达哪些标记。
  

二、了解流式细胞仪配置

• 搭配方案前，首先需了解你要使用的流式细胞仪，了解激光器和滤光片配置，知道可以使用哪些颜色，是否可以优化？
• 记录单染微球，以创建溢出扩散矩阵 (SSM)。
• 计算得到的SSM显示不同颜色通道溢出程度如何，并在SSM旁边标注上亮度或染色指数。
  

三、将颜色与标记进行匹配

• 将标记放置在Excel中SSM颜色旁边，如为共表达的标记，务必避免放在荧光溢出大的颜色中。
• 亮度高的颜色（即较大的染色指数）分配给表达密度低的抗原，反之亦然。
  

四、测试和优化

• 如果有多个克隆号，需通过多种方式确定要使用哪个克隆（如文献、试用等）。
• 检测并滴定抗体，确定最佳浓度（即染色指数最大，也就是意味着阳性群体最强且背景最低的平衡点）
  
• 可能需要特定的细胞系或刺激后的细胞作为阳性样本。
• 用全染的细胞进行评价。如发现问题，进行方案变更。
  

此时的SSM表格应该如下图所示：


五、应用方案

• 使用单染微球或细胞创建补偿。确保补偿在全染细胞上能产生令人满意的结果。
• 请注意补偿后的设置和 PMT 值不应改变。
• 使用手动逐级设门分析流式数据，或探索性分析无监督聚类方法。
  

信源：Holmberg-Thyden S, Grønbæk K, Gang AO, El Fassi D, Hadrup SR. A user’s guide to multicolor flow cytometry panels for comprehensive immune profiling. Anal Biochem. 2021;627:114210.

lukequ

受教了。

baron

倪老师您好，请教一下哈，这个SSM表要先用所有颜色的beads（APC、APC-R700、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV421、BV480、BV650、BV711、BV786、FITC、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy7）在流式仪上跑一遍补偿得到荧光溢出的吗？

niwanmao

baron 发表于 2024-3-28 10:38
倪老师您好，请教一下哈，这个SSM表要先用所有颜色的beads（APC、APC-R700、APC-Cy7、BUV395、BUV737、BV42 ...

是的

baron

niwanmao 发表于 2024-3-28 10:41
是的

好的，谢谢

rao_mingjin

倪老师您好，第二步了解仪器设置中的SSM的创建是需要采用marker和荧光搭配好的抗体进行，还是说可以采用相同marker（如CD4)，不同荧光素搭配的抗体创建?

niwanmao

rao_mingjin 发表于 2024-6-19 12:16
倪老师您好，第二步了解仪器设置中的SSM的创建是需要采用marker和荧光搭配好的抗体进行，还是说可以采用相 ...

一般最好是相同标记，尤其是串联染料。不过如果实在找不到，可以用这个方法