莫名其妙的阳性信号，原因你可能根本想不到

niwanmao

丹麦奥胡斯大学生物医学系Tulieca Jeyaseelan所在的实验室使用一个多色流式细胞术方案检测单个核细胞（PBMC）很多年了，以前一直很稳定，但最近突然出现异常结果，有些信号特别强，并且在少数样本中出现，却跟样本实验分组无关。

作者感到很奇怪，于是开始破案。

因为很多样本是在其他地方采集的，于是开始怀疑样本采集上的差异引起的。但是，在内部采集和染色的质控品中也观察到相同的问题。而之前使用相同的方案已确认过该质控品没有问题。

经过仔细的调查，转向了染色步骤。怀疑是染色过程中使用的记号笔导致荧光信号污染。


为了验证这个假设，使用三个不同的样本模仿染色过程，但不加入任何荧光素 抗体，只使用记号笔标记96孔板的孔位。A行是样本1，C行是样本2，E行是样本3。第1列：未标记孔，第3列：黑色笔标记孔，第5列：绿色笔标记孔，第7列：蓝色笔标记孔，第9列：红色笔标记孔。


结果如下图：


可见不同颜色的记号笔对未染色细胞的荧光产生了巨大影响：
- 红色记号笔标记孔在除了不会被红光激发，在蓝光、黄光、紫光激发通道，均呈现出非常强的非特异信号。
- 紫光通道（V445和V780），所有颜色的标记笔，均会出现明显的非特异性信号。
- Y586只受到红色标记污染，而Y780会被绿、红、蓝三种颜色标记污染。

看到这里，你是否感到毛骨悚然，不经意的一件事，竟然会引起如此的后果，极可能导致你的科研结果错误。

所以，以后在实验中，任何原材料尽量要选过，莫名其妙的阳性，需要从各个环节去找原因。用96孔板处理样本时，尽量不在孔边缘做记号，而是在纸上记下各孔对应的标本。但是话又说回来，我很奇怪为什么标记在96孔边缘，都会引起信号获取时出现非特异信号，要知道流式细胞仪获取的是孔里面的细胞，难道画圈的时候，记号笔的染料溅到孔内了？但作者并没有就其中的具体原理做深入探讨，我们也只能如此猜测。


信源：Jeyaseelan T, Romero-Ramos M, Petersen CC. Betrayal of the Markers [published online ahead of print, 2023 Jul 28]. Cytometry A. 2023;10.1002/cyto.a.24781. doi:10.1002/cyto.a.24781

zdvfsadb

还是在96孔板最上面空白处写字比较靠谱。。。他是怎么把颜料搞到孔里去的也挺神奇的

niwanmao

有站友反馈，细胞培养箱自带BV510阳性信号，只要放进去的细胞，该通道总是会有阳性。

btx362237729

正常人都不会这样做标记吧，也许是为了发文章讲的故事

lhzf4war

niwanmao 发表于 2023-7-31 08:42
有站友反馈，细胞培养箱自带BV510阳性信号，只要放进去的细胞，该通道总是会有阳性。 ...

这个会不会是因为站友的培养箱刚经过高锰酸钾或其他物质熏蒸灭菌，没有清除干净，或者在水盘中加了什么物质来抑菌，在培养时产生的蒸汽导致的自发荧光？

niwanmao

lhzf4war 发表于 2023-8-1 10:19
这个会不会是因为站友的培养箱刚经过高锰酸钾或其他物质熏蒸灭菌，没有清除干净，或者在水盘中加了什么物 ...

具体没细讲。确实都应该会有原因的。

wxd

标记在孔板口可能是无意造成的。因为96孔板在加样时因为孔太多的缘故，很容易在一个孔中加两次，或者漏掉其中一个孔。并且一个96孔板上很有可能会同时检测多个组别，为了加样方便，并且进行区分，很可能会在孔板上用线条画出若干个区域。划线的时候手不稳就容易标记到孔的内壁上。至于文章中那种，标记到内壁上，并且标记一圈，可能是他们实验室范围内使用的一个划分区域的方法，也可能是为了放大信号，便于检测所采用的策略。