结合图像和流式，进行基于细胞的「假病毒」中和试验，有利于替代研究高致病力病毒

niwanmao

SARS-CoV-2是导致全球COVID-19大流行的病原体。为了对抗SARS-CoV-2，人们已经开发了多种方法，包括RNA和病毒载体疫苗、新型抗病毒药物以及单克隆抗体。SARS-CoV-2使用刺突蛋白进入宿主细胞，并需要ACE-2和TMPRSS2宿主细胞受体。预测疫苗的有效性，关键在于确定中和抗体的滴度。

目前已经建立了几种方法来量化患者血清中的中和抗体滴度，包括活病毒、假病毒和基于ELISA的中和测定。然而，使用活性病原体SARS-CoV-2需要生物安全级别3（BSL-3）的限制，这对于大多数进行感染诊断、抗病毒药物开发的实验室来说是无法实现的。

本研究开发了一种基于VSV伪病毒的假病毒中和试验，使用SARS-CoV-2刺突蛋白和绿色荧光蛋白作为方便的感染报告指标。通过活细胞成像和流式细胞术测量中和效果。结果表明，两种读数方法都能够量化患者血清样品中的中和抗体的存在和缺失。与基于微球的血清学和中和试验相比，伪病毒试验显示出高相关性，ROC分析结果为高曲线下面积（AUC）。

下图是基于细胞的假病毒中和试验方案。将自然感染、接种疫苗或 SARS-CoV-2 血清阴性个体的血清连续稀释9倍。加入表达含有 GFP 报告基因的 Wuhan-Hu-1棘突蛋白的VSVΔG，最终 MOI 为0.5。血清和病毒混合物在37°C孵育1小时，然后加入 HEK293T-Ace2-TMPRSS2-mCherry 细胞中。立即将平板置于 Cytation 5 上进行延时成像16小时。成像完成后，在流式细胞仪上获取细胞。通过 MATLAB 或 FlowJo 分别测定成像或 FC 方法的 GFP 百分比。根据病毒和培养基对照孔归一化，计算减少百分比。测定两种方法的 NT50 值并进行比较。



下图是成像方法的分割 (A) 和流式细胞术方法的设门策略 (B)。

(A) 用明场和荧光成像进行活细胞成像。荧光成像使用 mCherry 鉴定所有细胞，绿色荧光蛋白 (GFP) 鉴定假病毒感染细胞。自动图像处理可分割总细胞（红色轮廓）和感染细胞（绿色轮廓）。可定量感染细胞百分比（37.2%感染）。图中显示了每种条件分析的9个细胞视野中的1个。得到的指标能够定量 HEK293T-ACE2-TMPRSS2 靶细胞中的感染和血清中和。

(B) 流式细胞术分析的设门策略对主要细胞群、单细胞和 GFP 阳性细胞设门。分析中仅包括具有至少1500个单细胞的孔。



信源：Izac JR, Kwee EJ, Tian L, et al. Development of a Cell-Based SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay Using Imaging and Flow Cytometry Analysis. Int J Mol Sci. 2023;24(15):12332. Published 2023 Aug 2. doi:10.3390/ijms241512332

PDF文件： ijms-24-12332.pdf (1.44 MB, 下载次数: 8)

2023-8-15 08:54 上传

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