流式检测表面标记需不需要固定？（在线等）

xyzxl · 发表于 2011-9-13 10:13:21

本帖最后由 xyzxl 于 2011-10-8 10:45 编辑

第一次做流式，有一些疑问，期待各位老师指点

1
流式检测肿瘤细胞两个表面分子，处理完后可能要2-4个小时才能上机，细胞不固定的话对检测有影响吗？先固定还是染完色再固定呢？用1%多聚甲醛还是乙醇呢？

2细胞洗液一定要用含有 2%BSA（牛血清白蛋白）、0.1%叠氮钠的 PBS吗？

3常温离心可以吗？一般用什么规格的离心管呢？

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上午把结果拷回来了（没分析好的），下了站里的流式分析软件和丁香园里的资料折腾了一下午，依旧一知半解，无从下手，还是把数据发上来好了
ps：拷的结果是我师姐之前做的，她当时说有阳性结果，请站里的前辈帮我分析分析吧！===================================
附件太大了，传不上来，传到115盘了
http://u.115.com/file/e659tf3n# lovo.rar 提取码 e659tf3n
http://u.115.com/file/cls53d99# HT_29.rar 提取码 cls53d99
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我做的流式结果取回来了，一个细胞系没有结果，另外一个细胞系有结果，但是细胞分群很不好，请各位老师帮我分析一下是什么原因呢？

PS：孵育完抗体之后漂洗不充分会不会出现上述结果呢？还是抗体本身的原因？

niwanmao · 发表于 2011-9-13 10:13:22

xyzxl 发表于 2011-9-13 10:13

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第一次做流式，有一些疑问，期待各位老师指点1
流式检测肿瘤细胞两个表面分子，处理完后可能要2-4个小时才 ...

1、一般来说，2－4个小时可以不固定，如果需要固定，用1％的多聚甲醛，染色完再固定。
2、洗涤可以直接用一般的PBS即可。
3、离心本来就常温的，一般染色都是在流式管中染的，离心也就直接离就行了。

xyzxl · 发表于 2011-9-13 11:44:07

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非常感谢哦！
再请教一个问题，你们一般用多少速度和时间呢？推荐的是300-400g，离心机上都是转速，换算好像很麻烦

niwanmao · 发表于 2011-9-13 13:15:26

xyzxl 发表于 2011-9-13 11:44

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非常感谢哦！

不是很严格，基本上1500－2000转/分。

xyzxl · 发表于 2011-9-13 21:51:56

本帖最后由 xyzxl 于 2011-9-16 09:38 编辑

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下午去做流式了，结果两个指标阳性细胞率都很少，都没办法分析。抗体之前师姐做过有阳性，老师帮我分析一下可能是哪里的原因呢，附操作
洗液：含2%BSA的PBS（PH=7.2 今天配的）
离心均为1800rpm*5min
1.细胞消化，加培养基终止消化，离心，洗液洗2遍
2.计数，稀释至终浓度1*10^6/100ul
3分组（1）空白组（2）PE-A 单标（3）APC-B单标（4）双标（5）双标各加100ul单细胞悬液
以下步骤均为避光下完成
4一抗冰上避光孵育30min
5 2ml洗液离心洗2次
6 400ul洗液重悬上机检测

niwanmao · 发表于 2011-9-13 22:09:47

xyzxl 发表于 2011-9-13 21:51

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下午去做流式了，结果两个指标阳性细胞率都很少，都没办法分析。抗体之前师姐做过有 ...

流式看结果，最重要的是图。请把散点图传上来。点击回复，单击“高级模式”就可以进入完整的编辑器传图片了。

从步骤上看没大问题。建议你把2、3两管单标去掉，因为 PE和APC不需要调节补偿。4、5为什么设两管双标？

xyzxl · 发表于 2011-9-13 22:48:29

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呵呵，回复好快啊，看来这地方是找对了，好感谢哦。
之前问的是一个师兄说要有单标的对照调补偿，我看资料这两个荧光不是一个通道的，我觉得是不是不需要调补偿，不过也不是很懂，第一次做就照做了
第二个双标是把抗体减量了的，看有没有影响，不过今天什么都没做出来，反而浪费抗体了。
图在做流式的老师那边，今天不能拷结果，还要等下星期，急人啊，我就先把文字发上来了，我会坚持汇报滴

niwanmao · 发表于 2011-9-14 08:47:55

xyzxl 发表于 2011-9-13 22:48

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呵呵，回复好快啊，看来这地方是找对了，好感谢哦。

建议抗体孵育时只要常温避光孵育即可，不要放冰上。
标不上的原因很多，有抗体的原因、标本的原因、检测者的原因。需要从各个方面进行排除，建议你最好同时做一个肯定表达这个标记的细胞，作为阳性对照。

chujindong · 发表于 2011-9-14 09:46:05

niwanmao 发表于 2011-9-14 08:47

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建议抗体孵育时只要常温避光孵育即可，不要放冰上。
标不上的原因很多，有抗体的原因、标本的原因、检测 ...

我现在也是常温孵育的。各个公司的说明不太一样，有的说要在冰上孵育，有的说常温下孵育。为什么建议不在冰上孵育呢？按理说似乎冰上孵育对荧光抗体更适合。

xyzxl · 发表于 2011-9-14 09:54:45

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同问。抗体说明书上说的是4°

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