用流式有效区分不同类型的光感受器外段分子，并评估视网膜色素上皮吞噬能力

niwanmao

RPE代表视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium)。

视网膜色素上皮是视网膜的一层细胞,位于视网膜感光层的外侧,紧邻脉络膜。

视网膜色素上皮细胞起到多种重要作用,包括:

• 吞噬和降解视锥外段 - 每天吞噬和降解大量脱落的视锥外段,维持视锥细胞和视网膜的正常结构和功能。
• 维持视网膜营养和血浆屏障 - 从血液吸收营养物质并运输到视网膜,同时形成血浆屏障防止血液成分进入视网膜。
• 重新吸收视锥循环所需物质 - 将视锥循环中必需的vitamin A等物质重新吸收利用。
• 吸收过剩的光线能量 - 含有黑色色素可以吸收过剩光线,防止光照损伤视网膜。
  

RPE对维持正常视功能非常重要。RPE功能衰退会引起各类视网膜疾病,如年龄相关性黄斑变性。评估RPE的吞噬功能可以帮助开发视网膜细胞治疗方法。

Liang H等人开发了一种新的方法来区分不同类型的光感受器外段(POS)，并评估RPE的吞噬能力。

为此，作者首先要找特异性的标记，可有效区分POS的两种亚型：ROS和COS。

• 杆视锥外段(ROS):来自杆状视锥细胞的外段部分。杆视锥细胞在哺乳动物视网膜中占主要比例(95%左右),形状为细长的棒状。
• 视锥外段(COS):来自视锥细胞的外段部分。视锥细胞在视网膜中所占比例较少(5%左右),其外段部分形状较宽短。
  

ROS和COS都含有光敏色素分子,负责吸收光线并启动神经活动的信号传导。

流式细胞术通过不同Rhodopsin（1D4、4D2）以及Opsin抗体，可以有效区分和定量ROS和COS两种POS亚型,为评估RPE的吞噬功能提供纯度可控的POS样本。

注：Rhodopsin是在视网膜的杆细胞中发现的一种对光敏感的受体蛋白，Rhodopsin由一种叫做opsin的蛋白质与一种叫做视黄醛的色素结合而成。当光线照射到视黄醛上时，它会改变形状并激活opsin。激活的opsin随后在杆细胞内引发一系列信号级联，从而产生视觉。

下图是用流式细胞术区分不同POS分子的过程。图c可见POS群体FSC和SSC高度异质，难以区分。图d和e使用Hoechst染料和ATP酶抗体，没有检测到有核细胞或视网膜碎片。图f使用两种Rhodopsin（1D4、4D2）抗体区分出杆视锥细胞种群。图2g使用opsin抗体识别出视锥细胞种群。



为评估流式细胞术是否可作为稳定性指示方法,作者使POS样本经历强制降解条件。将样本暴露于升高温度或光照压力后,采用流式细胞术分析。结果显示,在55°C加热30分钟的热压力下,POS中的杆视锥细胞种群比对照组显著减少约60%。同样,750 W/m2光照6小时的光压力处理也导致杆视锥细胞种群减少37%。这支持流式细胞术可用作指示POS稳定性及纯度检测的方法。


为了解POS质量对吞噬功能检测性能的潜在影响,作者采用经压力处理的同一批POS样本进行RPE吞噬试验。结果显示POS纯度的不同直接影响吞噬检测结果。使用降解的POS样品,RPE的吞噬活性更高。可能的原因是：压力条件下POS的破坏导致大量小的POS碎片形成，为pH敏感荧光染料提供更大的结合面，从而RPE细胞吞入更多染料。这就证明了监测POS样品质量，以确保获得可靠的RPE吞噬检测结果，是非常有必要的。

参考文献：Liang H, Wu Q, Guo XV, et al. Comprehensive Analysis of Photoreceptor Outer Segments: Flow Cytometry Characterization and Stress-Driven Impact on Retinal Pigment Epithelium Phagocytosis. Int J Mol Sci. 2023;24(16):12889. Published 2023 Aug 17. doi:10.3390/ijms241612889IF: 5.6 Q1