人外周血测th17细胞结果分析

wangmei19850809

这是我昨天的结果，不知问题出在哪里，请各位老师指教，谢谢！

niwanmao

wangmei19850809 发表于 2011-9-16 08:42

                               
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这是我昨天的结果，不知问题出在哪里，请各位老师指教，谢谢！

你这个CD4 FITC怎么荧光这么弱？哪个公司的？

调节PE漏到FITC的补偿不能用IL17，因为Th17的比例本来就很少，要选择那种表达强度高，比例多的标记，例如CD8 PE

wangmei19850809

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CD4 FITC用的是eBioscience的，做的时候用空白管就是什么也没加那个管设置电压条件，用FITC，PE设置的补偿条件，在这个条件下检测双标的细胞，具体流式操作我不太懂，有流式的实验老师操作。

niwanmao

wangmei19850809 发表于 2011-9-16 10:35

                               
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CD4 FITC用的是eBioscience的，做的时候用空白管就是什么也没加那个管设置电压条件 ...

eBioscience的抗体荧光大多偏弱。要调节补偿，建议最好用表达荧光强度高，而且比例高的那种标记。

wangmei19850809

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抗体（CD4-FITC,IL-17A-PE）已经买了，而且足够把所有试验做完，结合前面关于同型对照的帖子，您认为我目前在不换抗体的前提下，最需要改进的是什么，包括流式操作那一部分，那位老师说她没做过TH-17，也不太清楚，关于结果，一直也没有给我一个实质性的建议？

niwanmao

wangmei19850809 发表于 2011-9-16 10:51

                               
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抗体（CD4-FITC,IL-17A-PE）已经买了，而且足够把所有试验做完，结合前面关于同型对 ...

我觉得这个CD4的荧光绝对不行，太弱了，分群都分不开，我估计你补偿都调不好。
如果IL17也是一点阳性都没有，我觉得也要怀疑一下。我之前做过几百个外周血，起码有一小群分的开的阳性细胞存在。
我建议你联系销售商换抗体或者退货改订其它厂家的。然后再订两个同型对照。

chujindong

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是不是做FOXP3或者其他胞内标记的，最好都用表达强度高的表面标记来做补偿？

niwanmao

chujindong 发表于 2011-9-19 10:55

                               
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是不是做FOXP3或者其他胞内标记的，最好都用表达强度高的表面标记来做补偿？ ...

补偿调节应该都是需要用表面标记调节的，而且要表达强度高的才合适。

wangmei19850809

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老师，您好，我又做了一次，Black是空白，什么都没标，其他包括FITC、PE、FITC+PE及抗鼠的IgG同型对照，您再帮我看一下结果问题在哪里，如果抗体不行的话导师说可以再买，但我担心刺激、固定、破膜有问题，要是需要换抗体那么我买哪个厂家的更好一些，最好是比较好买的，当然不换抗体更好，谢谢您。

niwanmao

wangmei19850809 发表于 2011-9-19 21:12

                               
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老师，您好，我又做了一次，Black是空白，什么都没标，其他包括FITC、PE、FITC+PE及 ...

1、IL－17如果一点高表达的细胞就没有，肯定有问题。具体是抗体问题还是处理步骤，需要通过验证，例如从别人那里借一点做的出的IL17抗体，可验证问题出在哪方面。我之前帮别人检测外周血的IL17，CD3＋CD8－的那堆细胞中，会出现大约1－5％的阳性率（注意：是经常刺激的）。不知道你的标本有没有经过刺激？
2、CD4的表达绝对是偏弱的，跟阴性细胞都粘在一起，这种抗体我不喜欢，我们在临床检测中用的CD4 FITC分得很开，阳性细胞的荧光强度可以到10E2以上。