【样品制备】小鼠脾脏和胸腺细胞单细胞悬液制备时，样品里面容易有结块和沉淀

DC_Cooper

最近使用流式分析小鼠脾脏和胸腺淋巴细胞分群

在样品制备过程中，经常出现样品沉淀或结块。
还请大神们帮忙分析一下问题出在哪？
步骤：
小鼠脱颈处死，取小鼠脾脏和胸腺，称重，置于4℃ PBS上。
将组织研磨，使用70um细胞滤网以及5ml注射器橡胶头进行。
将研磨后的细胞悬液 350g 4℃ 离心5min。
弃上清，加入100ul PBS重悬，再加入1×Lysing Buffer（BD 555899）,涡旋   室温静置 15分钟。
350g 4℃ 离心5min。

弃上清，加入1ml PBS重悬。

350g 4℃ 离心5min。接下来进行表面染色。。。。。。

谢谢各位大佬。

wxd

这个是正常的现象。那些沉淀可能是结缔组织和脂肪的混合物。研磨组织的时候，一般不会直接用70微米的细胞滤膜进行，而是用200目的钢网先初步将组织研磨，收集到的细胞悬浮液经红细胞裂解和清洗后，用70微米滤膜过滤得到单细胞悬液。直接用细胞滤膜研磨我们也试过，因为网眼太小，不容易将组织研碎不说，产生的结块也比用钢网研磨产生的多。

niwanmao

我觉得两种可能性吧，一种是@wxd 站友所说的组织妍磨不彻底，另一种可能是研磨后的细胞在无营养的PBS中容易死亡，导致成团。

DC_Cooper

niwanmao 发表于 2023-9-21 12:41
我觉得两种可能性吧，一种是@wxd 站友所说的组织妍磨不彻底，另一种可能是研磨后的细胞在无营养的PBS中容易 ...

谢谢倪老师    因为我这边活死染色需要在无FBS/BSA的环境下进行，所以研磨的时候只能在PBS中进行了。研磨不彻底这个，我会进一步验证一下。谢谢

DC_Cooper

wxd 发表于 2023-9-21 09:31
这个是正常的现象。那些沉淀可能是结缔组织和脂肪的混合物。研磨组织的时候，一般不会直接用70微米的细胞滤 ...

谢谢老师，用钢网研磨的话，您有商品链接吗？是将钢网铺在50ml离心管口去研磨吗？还请老师指教

wxd

【淘宝】https://m.tb.cn/h.5UpDPec?tk=MyRUdAGhKKj CZ0001 「带柄细胞筛 标准筛 10-2000目 实验筛 可定做直径」
点击链接直接打开 或者 淘宝搜索直接打开
我们之前用的是这个带柄的（无菌操作方便一些），你们也可以买不带柄的。把细胞筛放到6cm培养皿或者10 cm培养皿（细菌培养皿或者细胞培养皿都行，保证无菌即可）中，钢网贴近培养皿底部，加入适量PBS或者生理盐水以使水面接触钢网。将组织放到钢网上，用5 mL或者10 mL注射器芯橡胶部分研磨组织至看不到明显的块状组织，用培养皿中的PBS冲洗钢网（此时钢网上可能会有絮状结块，无法被冲掉，忽略）。收集培养皿中的PBS进行离心，红细胞裂解，70微米滤膜过滤，得到单细胞悬液。

DC_Cooper

wxd 发表于 2023-9-22 08:49
【淘宝】https://m.tb.cn/h.5UpDPec?tk=MyRUdAGhKKj CZ0001 「带柄细胞筛 标准筛 10-2000目 实验筛 可定做 ...

好的好的   感谢老师！！！

家的感觉

DC_Cooper 发表于 2023-9-28 08:24
好的好的   感谢老师！！！

我们这边用的这样的70um的过滤网研磨脾脏或淋巴结等，刚好放到50ml的离心管上面，用注射器活塞研磨，但研磨的时候滴加PBS或Hanks液，保持组织湿润并促使细胞掉落到离心管底部，得到的细胞悬液裂红或分离。注射器活塞和过滤网可以清洗高压后烘干，循环使用。研磨的时候按顺时针或逆时针轻轻研磨，研磨力度不可过大，也有使用大家说的在培养皿中用尼龙网膜研磨的，主要看手法。

DC_Cooper

家的感觉 发表于 2023-9-28 15:20
我们这边用的这样的70um的过滤网研磨脾脏或淋巴结等，刚好放到50ml的离心管上面，用注射器活塞研磨，但研 ...

好滴  谢谢老师

hydwl2019

家的感觉 发表于 2023-9-28 15:20
我们这边用的这样的70um的过滤网研磨脾脏或淋巴结等，刚好放到50ml的离心管上面，用注射器活塞研磨，但研 ...

请问一下，hanks液体用含钙镁的还是不含的