一种安全高效的细菌死活检测的流式细胞术方法

niwanmao

Servain‐Viel S等人在最新一期Cytometry A上发表了一项研究，提出了一种用于安全准确检测细菌死活的流式细胞术方法，利用可固定的死活染料和特定的标记步骤区分活细菌和死细菌，并在不同类型的细菌和长期细菌培养监测中展示了其有效性，不仅有效评估细菌死活，同时最大程度地减少化学风险和细胞仪污染的风险。

作者研究了三种不同染料组合：eFluor 780—SYTO 9、eFluor 780—SYTO 24和eFluor 506—DRAQ5。

步骤

活菌：使用新鲜培养物

死菌：无菌取每种新鲜培养物的一部分（至少2 mL），并在 100C 下加热1 h，即为死细菌，作为阳性对照。

每次标记均在1.5 mL聚丙烯 (PP) 微量离心管中进行。每种条件下使用的细菌数量固定为2×10E6。

先染可固定的死活染料：离心样本 (2000 g， 120 s)，在 PBS-EDTA 1 mM 中洗涤一次，并重悬于50 μL稀释的可固定死活染料 eFluor 780 或506（1/100，稀释在 PBS-EDTA 1 mM 中）中。细菌在4℃下避光孵育30 min。

接着固定：用 1 mM PBS-EDTA(2000 g， 120 s) 洗涤两次，并重悬于100 μL 4%PFA中，在室温下避光固定30 min。

最后染核酸染料：DNA 标记前，用 PBS-EDTA 1 mM 洗涤固定后的细菌两次。根据标记物组合（eFluor 780—SYTO 9、eFluor 780—SYTO 24和eFluor 506—DRAQ5），将细菌混悬于对应的核酸染料中，例如500 μL SYTO 9（终浓度为2.5 μM）、500 μL SYTO 24（终浓度1.25 μM）或200 μL DRAQ5（终浓度25 μM），并在37℃避光孵育30 min。

全部染色完成，再洗涤细菌两次，重悬于200 μL 1 mM PBS-EDTA中，并转移至1.2 mL PP管中，上机检测。




哪种综合最佳

三种组合（eFluor 780—SYTO 9、eFluor 780—SYTO 24和eFluor 506—DRAQ5）在不同细菌群体中均呈现出可靠的结果。不过，与 SYTO 9 和 DRAQ5 相比，SYTO 24的染色强度更高，SYTO 24+ 群体特征在新鲜培养物上更少。这表明eFluor 780—SYTO 24组合可能提供更好的亮度，且使得活菌和死菌之间更明显的分离。

不过，最佳染料组合的选择可能取决于实验或项目的具体要求。

每种组合都有其优点，在选择细菌死活检测的最佳染料组合时，建议考虑与细胞仪的兼容性、发射光谱/激发光谱、添加其他标记物的空通道的可用性等因素进行选择。

这种新染色方式，是如何实现污染风险最低的？

首先，避免了使用被分类为致癌性、致突变性和生殖毒性 (CMR) 的染色物质（如碘化丙啶等），减少了用户暴露于这些有害化学品。

其次，在死活标记后进行固定，有助于保护细胞仪免受细菌污染的风险。细菌如果污染流式细胞仪，会导致样本之间的交叉污染，并影响结果的准确性。

此外，通过尽量减少破膜剂的使用和减少废弃物的产生，有助于环境保护和降低平台的运行成本。

参考文献：Servain‐Viel S, Aknin M ‐L., Domenichini S, et al. A flow cytometry method for safe detection of bacterial viability. Cytometry Pt A. 2023;cyto.a.24794.