细胞周期流式求助！

刘文

我试过用6孔板，T25或者大皿收集，收集时的细胞密度为80%左右。（目前我只用control组试验，还未用药刺激）
1.离心去上清，PBS清洗一遍
2.加入250ulPBS将细胞吹成单细胞悬液，缓慢滴加预冷750ul无水乙醇。
3.固定过夜（12-24h）后PBS清洗2遍后，加染液孵育上机。
我试过固定30min,1小时，12小时24小时
24小时时连G2期都没有了
剩余的几个时间段就像图片一样的结果Cv值,分峰不明显。
试过4度固定还有-20度固定区别不大。
刚开始跑出来只有一个单峰，连S期都没有，我考虑是不是细胞生长密度太多产生抑制的原因，后来细胞60%就开始收样，出现了后面的S及G2期，但是一直CV值过高之前有30左右现在改变固定时间（减少之后)CV值20左右，但是仍达不到预期结果

刘文

各位专家，老师好。周期前前后后做了十次左右，但是一直出现分峰不明显的问题。
1.细胞状态不好?但是是六月份新买的细胞，上机也很少碎片就是不分峰。
2.固定时间和温度:试过固定30min-24 小时，温度4/-20，但是结果好像都差不多。

有同学说是因为我们那个流式机无法采用线性模式，导出来就是对数㏒的?
还有说不用固定做细胞周期…但是不固定怎么染上染料，我没试过。
不知道问题出在哪里？
完完全全按照说明书来的就是没有结果，但是这个实验又是课题重要的一环，不知道咋办…

niwanmao

刘文 发表于 2023-10-11 12:18
各位专家，老师好。周期前前后后做了十次左右，但是一直出现分峰不明显的问题。
1.细胞状态不好?但是是六月 ...

使用的试剂、步骤，都分别罗列一下看看，我个人感觉还是出在染色上。

刘文

niwanmao 发表于 2023-10-11 14:17
使用的试剂、步骤，都分别罗列一下看看，我个人感觉还是出在染色上。

老师，我使用的是碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。
固定完成之后，PBS清洗2遍之后，加入染料常温孵育20-30分钟。
试剂盒PI染液配置:如图片所示我将染液混匀之后加进离心去上清的细胞沉淀中去，然后混匀孵育。

niwanmao

刘文 发表于 2023-10-11 16:17
老师，我使用的是碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。
固定完成之后，PBS清洗2遍之后，加入染料常温孵育20-30 ...

很多时候，实验结果都是因为细节而改变。

目前暂时无法明确你的操作细节，但要注意的是：
1、70％的乙醇必须是4℃的。
2、固定时，必须在震荡器上，边震荡70％乙醇，边滴加细胞悬液
3、PI染液中的RNAse不可缺少。

zjl894150094

刘文 发表于 2023-10-11 16:17
老师，我使用的是碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。
固定完成之后，PBS清洗2遍之后，加入染料常温孵育20-30 ...

我也是最近用这个试剂盒，按照它的protocol做的，跑了2次正常细胞组，都是一个单峰，看不到G2。用的BD fortessa PE通道，请问你后来解决了吗

niwanmao

zjl894150094 发表于 2023-10-12 11:57
我也是最近用这个试剂盒，按照它的protocol做的，跑了2次正常细胞组，都是一个单峰，看不到G2。用的BD fo ...

是正常什么细胞？如果外周血的细胞，本身就是单峰的。

AAAAAjjj

https://zhuanlan.zhihu.com/p/157 ... ;s_r=0&utm_id=0
这个是比较详细的细胞周期染色的步骤，我之前补实验就是照着这个做的，一次就做出来了，CV值很低。比较重要的一点是你不能直接用实验室和用的消毒酒精去固定，要用无水乙醇稀释为70%的乙醇。还有就是固定时间不用过夜，冰上固定半个小时就可以了。
具体的细节你看看我发的链接。

刘文

niwanmao 发表于 2023-10-11 20:35
很多时候，实验结果都是因为细节而改变。

目前暂时无法明确你的操作细节，但要注意的是：

好的老师，谢谢，我再重新做，注意细节

刘文

AAAAAjjj 发表于 2023-10-12 17:50
https://zhuanlan.zhihu.com/p/157591735?utm_source=wechat_session&utm_medium=social&s_r=0&utm_id=0
这 ...

好的，谢谢。我是用的无水乙醇。
250ulPBS+750ul无水乙醇