心脏免疫细胞

瓜瓜999

请问有朋友用过percoll提取心脏的免疫细胞吗？
问题1： 我尝试了percoll提取，和无percoll提取，两种protocol。


用percoll提取的sample，做FACS的时候耗时很短，CD45+细胞多。
无percoll提取，做FACS的时候一个sample要耗时13-15分钟，CD45+相对少。
目前还没有完全分析完结果，现在比较感兴趣的是为什么大部分文献都不用percoll呢？

问题2：因为心脏的免疫细胞比较少，而且我要测myeloid cells和lymphocytes两个panel。所以我没有计数直接把sample均分两份进行staining。
我看其他protocol，比如：transfer 1*10^6 cells for staining。
如果不计数直接均分进行staining，是不是影响后续比较或统计？

最近要准备做实验了，我还是新手很多不太懂，同时我们的heart protocol一直不稳定，老板想直接做。但是我不想浪费sample，所以如果protocol仍需改进的话，我就把我的sample冻起来，而不是直接做流式。
谢谢大家

niwanmao

首先，其实是不建议把细胞冻起来，冻存毕竟是个对操作技巧要求蛮高的过程，易损伤细胞，还是强烈建议新鲜做。

其次 ，建议用Percoll提取一下，有助于去掉一些碎片和死细胞

最后，分管染色前，还是建议计数一下，正因为细胞少，所以要更珍惜细胞，细胞多的稀释一下再分（确保染色质量），细胞少的，直接分两管

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-10-27 12:11
首先，其实是不建议把细胞冻起来，冻存毕竟是个对操作技巧要求蛮高的过程，易损伤细胞，还是强烈建议新鲜做 ...

谢谢老师回复，我是想冻起来做其他的实验。如果我们的protocol不是很成熟的话，我觉得做了也是浪费，因为我要用一整个心脏做流式。
我之前提了细胞后镜下看，有些sample细胞多，有一些少，大概相差了三倍左右。我们最开始是根据少的sample决定染多少细胞，流式结果分析细胞数量特别少。后来我们决定不管细胞多少，直接分两管进行staining。但是不知道这样会不会影响之后的分析结果。

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-10-27 12:11
首先，其实是不建议把细胞冻起来，冻存毕竟是个对操作技巧要求蛮高的过程，易损伤细胞，还是强烈建议新鲜做 ...

这是我们用percoll和无percoll做的，后续的gate在附件里，非常感谢老师 流式结果.pdf (733.85 KB, 下载次数: 6)

2023-10-27 14:52 上传

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流式结果

CDC

瓜瓜999 发表于 2023-10-27 14:52
这是我们用percoll和无percoll做的，后续的gate在附件里，非常感谢老师

您好，我看您的Ly6G分的很好，请问您方便分享您的配色方案和抗体货号吗，太感谢啦

瓜瓜999

CDC 发表于 2024-7-26 09:28
您好，我看您的Ly6G分的很好，请问您方便分享您的配色方案和抗体货号吗，太感谢啦 ...

Ly6G-BV510 (biolegend, cat127633)