GFP标记组蛋白：流式监测酵母细胞周期的新利器

niwanmao

传统的DNA染色方法涉及使用荧光染料，如PI或SYBR Green，对固定的细胞进行DNA染色。这种方法主要通过流式细胞术进行检测，这是一种快速、可靠且定量的方法。但是，为此检测准备细胞的步骤相对繁琐，因此该方法并不常用于高通量研究。
另外，传统的DNA染色方法的一个主要缺点是需要对细胞进行固定处理。固定步骤会使GFP荧光淬灭。
传统方法也很难同时监测其他参数，如一些蛋白或基因标记。
与此相反，染色质丰度定量法(HAQ)可在活细胞中直接监测，而无需对细胞进行任何处理。​HAQ还可以与其他荧光标记物（如荧光蛋白）结合使用，以确定细胞周期阶段如何影响各种细胞参数。

Kulakova MV等人在2023年10月20日的J Fungi (Basel)杂志上提出了一种新的方法，通过流式细胞术检测标记了绿色荧光蛋白(GFP)的组蛋白Htb2的丰度，从而监测活细胞中的细胞周期变化。这种方法称为组蛋白丰度定量(Histone Abundance Quantification, HAQ)。作者证明这种方法能提供与DNA水平高度一致的数据，适用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和多形酵母(Ogataea polymorpha)。

首先，为了确认HAQ的准确性，需做传统细胞周期检测，但为了提高传统细胞周期检测的速度，在细胞洗涤前引入了一个快速乙醇固定步骤，不仅提高了速度还增加了重复染色的一致性。为了实现即时固定，在 1.5 mL 的微离心管中，将 0.4 mL 的酵母培养物与 1 mL 冰冷的 96% 乙醇快速混合，孵育 15-20 分钟后，离心沉淀细胞。将细胞沉淀重新悬浮于 1 mL 水中，并剧烈涡旋震荡，以确保细胞沉淀完全碎裂，再次离心，将细胞重新悬浮在 70% 的乙醇中，并保存在 4℃ ，直至染色。

其次，发现蛋白酶处理对 Ogataea 细胞过于苛刻，因此省略了这一步骤。


随后，作者测试了 10 种不同的 GFP 标记的组蛋白，以观察组蛋白丰度是否与 DNA 含量相关，结果发现Hta2-GFP和Htb2-GFP的双峰荧光分布与DNA染色相似，表明与DNA含量相关。


因此，选择 Htb2-GFP 进行进一步实验。
在酿酒酵母和多形性酿酒酵母中创建了表达 Htb2-GFP 的菌株，将这些菌株培养到对数期和静止期，并通过流式细胞术对其进行分析，将 Htb2-GFP 丰度与来自相同培养物的固定和染色细胞的 DNA 含量进行比较。结果发现，在两个生长阶段和两种酵母菌中，Htb2-GFP 丰度与 DNA 含量之间都有很好的相关性。
作者用抑制细胞周期的药物羟基脲和 5-氟胞嘧啶处理对数期的 Htb2-GFP 培养物。流式检测结果显示，如预期那样，Htb2-GFP丰度和DNA染色的1c峰消失了，而2c峰则出现了明显增高。这表明组蛋白丰度定量（HAQ）与DNA染色同样反映了细胞周期的变化。
最后，作者创建了一种共同表达 Htb2-GFP 和红色荧光钙感受器 R-GECO 的 O. parapolymorpha 菌株，以证明 HAQ 与其他荧光素的兼容性，结果发现在 2c 细胞部分能观察到较高的 R-GECO 信号，这证明了染料之间的兼容性，也证明了细胞周期晚期的钙离子水平较高。
总之，带有 GFP 标记组蛋白的 HAQ 为监测活酵母细胞的细胞周期状态提供了一种简单、非侵入性的方法，避免了费力的固定和染色过程，结果与 DNA 染色一致。HAQ 与其他荧光素兼容，可同时监测细胞周期阶段和其他参数。作者在酿酒酵母和多形性酿酒酵母中对 HAQ 进行了验证，表明它具有广泛的适用性。HAQ有望成为高通量筛选细胞周期变化的工具。

参考文献：Kulakova MV, Ghazy ESMO, Ryabov F, Stanishevskiy YM, Agaphonov MO, Alexandrov AI. Histone Abundance Quantification via Flow Cytometry of Htb2-GFP Allows Easy Monitoring of Cell Cycle Perturbations in Living Yeast Cells, Comparable to Standard DNA Staining. J Fungi (Basel). 2023;9(10):1033. Published 2023 Oct 20. doi:10.3390/jof9101033