CRISPR基因编辑是否有效，用流式检测这个基因可以快速有效监测

niwanmao

CRISPR/Cas系统是一种高级基因组编辑技术，可以通过修复由野生型CRISPR/Cas（Cas核酸酶）在预定基因组位置创建的双链断裂（DSBs）来实现基因敲除和靶向敲入。

然而，基于DSB的靶向敲入缺乏精确性和特异性，因为在靶点和非靶点基因组位点上频繁发生插入和缺失。为了解决这个问题，已经开发了基于Cas9切割酶的各种精确靶向敲入方法。这些方法包括在基因组DNA和供体DNA中引入切割位点，以增加靶向敲入的效率，通过与Cas9切割酶融合的脱氨酶介导的碱基编辑来创建编程的单碱基替代，以及通过与Cas9切割酶融合的逆转录酶促进不同类型的精确基因组编辑的主要编辑。然而，为了在各种实验设置中确保靶向敲入的高效性、精确性和特异性，改进和优化这些方法仍然至关重要。

**为了提高目标基因敲入的效率，需要先建立一个敏感的分子系统来监测敲入的发生。T7E1和Surveyor检测方法不能区分正确编辑的DNA链和不想要的indels。深度测序分析是一种常用的策略，但成本较高。常用的限制性酶切分析方法灵敏度不够。**

Hasan MN等人开发了一种分子系统，利用PIGA基因作为平台，报告了有针对性的敲入的效率。PIGA位于X染色体上，是合成糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚点所必需的。通过在雄性二倍体细胞中破坏PIGA等位基因，细胞表面会丢失GPI锚点，利用PIGA纠正实验评估了有针对性的敲入的效率，该实验具有灵敏度高、背景噪音低、高通量、简单和经济的特点。

但是，通过利用PIGP和CD55基因，已经生成了监测靶向敲入效率的不同分子系统。PIGP是产生GPI锚点的另一个基因，CD55是分布在细胞膜上的GPI锚定蛋白。通过使用流式细胞术分析细胞，可以评估这些基因的活性和非活性，从而对靶向敲入的效率进行敏感监测，类似于PIGA修复试验。然而，由于PIGP和CD55都是常染色体基因，研究人员必须首先失活这些报告基因的一个等位基因，以准确测量报告基因编辑的频率。为了评估PIGP和CD55的靶向敲入，应该消除这些报告基因的一个等位基因，并使另一个发生突变，以使野生型供体DNA只能与报告等位基因发生同源定向重组。这种基因组操作需要大量的时间和精力来量化靶向敲入的发生率。此外，基于PIGA、PIGP和CD55的上述试验依赖于GPI锚定生物合成途径。因此，当GPI锚定合成由于GPI锚定生物合成基因的改变或表达丧失而受损时，这些试验将无法发挥作用。

L1CAM基因位于X染色体上，不参与GPI锚定生物合成，且在许多人类细胞系中强表达，可替代PIGA基因作为基因组编辑效率的标记。

## 实验方法
研究使用 CRISPR/Cas9 技术破坏人类细胞系中的 L1CAM 基因，使用Cas9 nucleases或nickases以及 Donor-L1CAM 来评估靶向基因敲入的效率。

使用不同浓度的抗体对培养细胞进行染色的实验。使用的抗体包括两种抗人L1CAM的鼠标单克隆抗体（5G3和UJ127.11），以及两种与鼠标IgG（H+L）结合的二抗（Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594）。这些抗体经过稀释后与细胞进行染色，用于实验研究。

高表达 L1CAM 的近二倍体雄性细胞系可用于该检测。使用抗 L1CAM 抗体 (5G3) 可以基于 FCM 对 L1CAM 干扰细胞进行定量。


## 研究结果
使用Cas9核酸酶干扰L1CAM基因，并通过荧光标记和流式细胞术检测到L1CAM的消失。L1CAM消失后，细胞表面的Alexa Fluor 488标记也消失了。通过流式细胞术分离Alexa Fluor 488阳性和阴性的细胞，验证了Alexa Fluor 488阴性细胞的L1CAM基因已经被干扰。


此外，作者发现，L1CAM干扰的细胞和正常细胞的生长速度相同。

研究发现，通过转染针对编码L1CAM细胞外区域的外显子（ex2-2、ex4-1、ex5-1、ex26-1和ex26-2）的Cas9核酸酶，可以有效地破坏L1CAM。然而，针对外显子3（ex3-1和ex3-2）的Cas9核酸酶并不能增加Alexa Fluor 488阴性细胞的数量，这可能是因为L1CAM外显子3是一种可变外显子。RT-PCR分析表明，在L1CAM外显子2-4之间，存在两个不同大小的PCR产物，其中一个亚群的L1CAM mRNA中缺少外显子3，证明了外显子3的可变剪接。

为了有效监测L1CAM失活事件，需要针对编码L1CAM细胞外区域的外显子进行破坏。针对跨膜区域内或下游的Cas9核酸酶会导致较少的Alexa Fluor 488阴性细胞，可能是因为L1CAM跨膜区域的不完全废除使得细胞外区域在一部分转染体中仍然保留在细胞膜上。当Cas9核酸酶靶向距离跨膜区域相对较远的基因组部分（ex27-1-4）或L1CAM基因的5'-UTR（ex1-1和ex2-1）时，未检测到Alexa Fluor 488阴性细胞的显著增加。

作者进一步研究了Cas9核酸酶对L1CAM和PIGA的破坏作用，并通过流式细胞术检测了细胞的L1CAM和PIGA破坏率。实验结果表明，L1CAM和PIGA的破坏率在4到14天之间变化不大。同时，FLAER可以用于PIGA的检测。

对于SK-N-BE(2)细胞，使用Cas9核酸酶破坏L1CAM和PIGA基因的FCM分析时间不同。L1CAM破坏后4天即可进行FCM分析，而PIGA破坏需要至少14天才能准确分析。



基于流式细胞术对 L1CAM 基因被破坏细胞进行定量分析，在评估基因组编辑效率方面很实用。有助于推动基因组编辑技术的发展，并为该领域的进一步研究奠定了基础。


参考文献：Hasan MN, Hyodo T, Biswas M, et al. Flow cytometry-based quantification of genome editing efficiency in human cell lines using the L1CAM gene. PLoS One. 2023;18(11):e0294146. Published 2023 Nov 9. doi:10.1371/journal.pone.0294146 IF: 3.7 Q2