肿瘤免疫细胞提取后镜下数细胞

瓜瓜999

提取肿瘤里的免疫细胞，percoll提取后，需要镜下数细胞，之后再染色。

我在数细胞这一步遇到了问题，看到多数protocol里只写count cells for staining。但是我在镜下发现细胞大小不一样，那么protocol里数细胞是指数所有的live cells还是数某一特定性状的呢？

肿瘤组织提取免疫细胞

如图，里边的live cells有大有小。这样的话count cells是数全部的吗？

非常感谢~

niwanmao

首先，你这里的细胞太密了，建议进一步稀释后再计数。
其次，建议背景用白色，然后对细胞使用台盼蓝染色后，再计数活细胞数量

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-11-20 07:35
首先，你这里的细胞太密了，建议进一步稀释后再计数。
其次，建议背景用白色，然后对细胞使用台盼蓝染色后 ...

谢谢老师，我印象中显微镜背景是白色，我这个是用台盼蓝染色后镜下观察，蓝色背景应该是台盼蓝的颜色。老师那数细胞的话是数全部的吗，不论大小是否一样？

wxd

Protocal里的计数后染色，是为了让你调整细胞密度到一千万个细胞每毫升以免细胞数量过多导致抗体量不足引起的染色不充分。因此，刚开始做实验的话，建议不论大小全部计数，然后在流式细胞仪FSC/SSC中看哪一群属于待分析的目标细胞群。

niwanmao

瓜瓜999 发表于 2023-11-20 09:30
谢谢老师，我印象中显微镜背景是白色，我这个是用台盼蓝染色后镜下观察，蓝色背景应该是台盼蓝的颜色。老 ...

如wxd站友所说的，细胞都数进去

瓜瓜999

wxd 发表于 2023-11-20 17:12
Protocal里的计数后染色，是为了让你调整细胞密度到一千万个细胞每毫升以免细胞数量过多导致抗体量不足引起 ...

非常感谢，请问有关于这一方面的文献或资料吗？我查了好久都没有找到。因为流式实验主要是由带我的博后主导，她之前只做过spleen和colon，她一直说只数小的圆的亮的细胞。。。。。。我想给她看一下

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2023-11-21 07:40
如wxd站友所说的，细胞都数进去

非常感谢老师~~

wxd

因为染色前调整细胞数量几乎是常做流式实验的人的常识，所以平时并没有注意有没有这方面的文献，不过应该是没有的。之所以有这个认识，是因为在平时的工作中，有初学流式者犯过这样的错误，并且在流式抗体说明书中通常会有一句话“最好能做一个抗体滴定实验以确定最佳用量”，说明细胞密度会影响染色结果。
你目前的主要目标是拿到流式结果，细胞计数是一个很小的问题，知道方法后直接做就行了，不值得你专门告诉博士后你是怎么计数的，也不值得你浪费时间专门查阅文献。
最后，鉴于你要查文献跟指导你实验的博士后抬杠这一行为，给你个忠告：无论实验结果如何，给她买一些零食或者水果。

瓜瓜999

wxd 发表于 2023-11-21 13:24
因为染色前调整细胞数量几乎是常做流式实验的人的常识，所以平时并没有注意有没有这方面的文献，不过应该是 ...

非常感谢您的建议。其实我不是想抬杠，只是想知道哪种是正确的方法。因为数全部的活细胞，和只数小的圆的活细胞，差别很大，所以不知道最后结果是不是准确的。

wxd

还是那句话，全部数了，做个预实验看看就行了。