神经免疫学研究中流式细胞术方法的标准化

niwanmao

流式细胞术已成为研究大脑免疫系统及其在神经系统疾病中作用的一种重要工具。通过识别和计数大脑中不同免疫细胞亚群，可以深入了解正常大脑免疫功能以及在阿尔茨海默病、帕金森和多发性硬化症等疾病中免疫是如何被破坏的。

然而，发表在《Frontiers In Immunology》上的一篇新的系统综述认为，“神经免疫学流式细胞术”领域需要标准化。研究人员Robert Sharp、Dylan Guenther和 Matthew Farrer 检查了58项已发表的研究，这些研究均利用流式细胞术分析了从野生型小鼠大脑中分离出的免疫细胞，寻找这些实验的变异性和不一致性。


不同研究之间使用的小鼠品系、年龄和性别等因素差异很大。制备分析用细胞的脑解离和酶消化技术也远未统一。流式细胞仪和分析软件来自不同的厂家，鉴定细胞类型的抗体并不总是详细写出。最令人震惊的是研究之间实际免疫细胞计数的巨大差异-在某些情况下，标准差超过了平均值！

我们来详细看一下：

小鼠品系、年龄和性别：

• 使用多种 C57BL/6 亚系，包括C57BL/6、C57BL/6J、C57/BL6和 C57BL/6J(B6)
• 小鼠年龄范围宽，从1-2周龄至26月龄不等
• 大多数研究仅使用雄性小鼠，但一些研究使用混合或仅使用雌性小鼠

脑分离技术：

• 方法包括单独机械匀浆、单独酶消化或组合
• 多种酶用于消化包括胶原酶、DNase、胰蛋白酶-EDTA 等。
• 使用不同尺寸（70 μm、100 μm等）的细胞过滤器
• 用于髓鞘去除的 Percoll 梯度浓度范围为30%-70%

流式细胞仪仪器：

• 使用了不同的细胞仪/细胞分选仪，包括BD LSRII、BD FACSCalibur、BD FACSAria III等。
• 分析软件包括BD FACSDiva、FlowJo、Cytobank等。

抗体报告：

• 抗体克隆、荧光素、靶抗原并不总是明确说明
• 有时缺失重要详细信息，如生产商/公司来源

不同研究之间实际免疫细胞计数观察到较大变异，在WT/对照小鼠大脑中报告的各种免疫细胞亚群，包括 T 细胞亚群、小胶质细胞、NK细胞等，Robert Sharp等人用中位计数和四分位距 (IQR)进行统计，还分析了平均计数和标准差 (SD)，发现报告的计数变异巨大，SD通常超过平均值。
例如：

• 小胶质细胞（4项研究报告）的中位计数为72300个细胞 (IQR = 194038)，平均值为90323个细胞，SD为±104555个细胞
• CD4+ T细胞计数（在27项研究中报告）的中位数为2100个细胞 (IQR = 5000)，平均值为3200个细胞，SD为±3000个细胞
• NK细胞计数（5项研究报告）的中位数为180个细胞 (IQR = 500)，平均值为220个细胞，SD为±250个细胞

可见，对于相同的免疫亚群，不同研究之间的数量差异很大，几乎都是SD大于平均值本身。如此广泛的差异使得研究间结果的比较和汇总非常困难。

Robert Sharp等人指出，这对结果的可重复性和解释提出了挑战。随着神经免疫在阿尔茨海默病和帕金森等疾病中的重要性现在得到确认，需要标准化的方法来加速发现。

基于上述的分析，Sharp等人提出了一些报告小鼠大脑流式细胞术实验的建议，例如应详细说明小鼠背景详情、灌注技术、解离方法、仪器信息、抗体克隆和完整门控策略等事项。还必须记录每份样本的总细胞和活细胞计数。采用标准化实践有助于解决当前问题，并能够进行更稳健的比较和荟萃分析，才能优化流式细胞术对解开免疫在大脑中的复杂作用的贡献。

参考文献：Sharp RC, Guenther DT, Farrer MJ. Experimental procedures for flow cytometry of wild-type mouse brain: a systematic review. Front Immunol. 2023;14:1281705. Published 2023 Oct 30. doi:10.3389/fimmu.2023.1281705

Jeffery_9

确实如果每篇文章都能详细记录，follow的时候要清晰很多，期待更多有关神经免疫的流式方法。想请问下倪老师有没有看到过外周感觉神经，比如DRG的流式细胞术相关文章

zdvfsadb

个人感觉，有没有采用CD45 iv排除血源性免疫细胞也是导致异质性的重要原因

niwanmao

Jeffery_9 发表于 2023-12-5 21:06
确实如果每篇文章都能详细记录，follow的时候要清晰很多，期待更多有关神经免疫的流式方法。想请问下倪老师 ...

外周神经方面看的比较少，您是做这一方面的研究的吗？

Jeffery_9

最近想往这个方面探究，但好像只看到过这一篇文章有关于流式实验的：Science. 2022 May 13;376(6594):eabd5926. doi: 10.1126/science.abd5926