使用流式细胞术实现SARS-CoV-2新型微量中和试验

niwanmao

在COVID-19大流行期间，跟踪SARS-CoV-2的变异并评估免疫反应的重要性前所未有地凸显出来。了解感染或接种疫苗后产生的中和抗体水平对于流行病学研究、临床试验以及治疗性抗体的开发至关重要。尽管空斑减少中和试验（PRNT）仍被视为金标准，但高通量测试的开发使得能够筛选更大规模的样本群体成为可能。Sophie O'Reilly等人介绍了一种新型微量中和试验，利用流式细胞术快速测定临床样本中的SARS-CoV-2中和抗体水平。

实验步骤

基于SARS-CoV-2的微量中和试验工作流程如下：

• 在96孔深孔板中，使用感染培养基连续稀释经热灭活（56摄氏度下30分钟）的人血浆样本（8个浓度梯度，1:20的对数减半）。
• 在标准96孔板中进行病毒中和实验，将不同浓度的抗体稀释液与野生型SARS-CoV-2或相关变种（VOC）在37摄氏度下共同孵育60分钟。
• 使用抗体-病毒混合物感染已融合的Vero-E6或Vero-E6/TMPRSS2细胞，并在96孔板中于37摄氏度下孵育18小时。每个板可以同时检测一份针对三种SARS-CoV-2变种的血浆样本，一式两份，包括对照组（仅病毒和仅培养基）或仅一种变体的三份样品。
• 对细胞进行胰蛋白酶处理、固定（4%甲醛）、破膜和细胞内SARS-CoV-2 NP染色。使用流式细胞术测量感染情况，首先选择活单细胞群，然后选择NP阴性和阳性群。
• 分析流式细胞术数据以确定每孔感染（NP+）细胞的百分比，然后通过将各稀释液归一化为阳性和阴性对照来确定抑制百分比。根据抑制曲线可以测定NT50，即导致50%感染抑制的稀释因子。

新试验方法采用了SARS-CoV-2活分离株，并在抑制水平3进行了验证，用于测定功能性中和抗体。一个关键优势是能够在标准96孔板上并行处理多个样品和病毒变种。

流式细胞术终点的优势

与斑块减少或细胞病变效应（CPE）等视觉终点相比，流式细胞术提供了感染水平的客观和定量测量。大量表达的NP蛋白染色在感染18小时后可以明确区分感染和未感染细胞。这个时间点是最佳的，足够长的时间来获得稳定的NP表达，但避免了广泛的CPE。

重要的是，固定可以灭活任何剩余的活病毒，使得在生物安全柜内的小型流式细胞仪上以二级防护水平对板进行安全分析成为可能。自动化采集消除了用户在确定阳性染色孔时的主观性。

在广泛稀释系列中评估感染细胞的百分比，以定义中和曲线并使用非线性回归分析测定NT50滴度。96孔格式能够并行筛选多个变种、时间点或队列。总的来说，这种中等通量的检测方法在重现性、快速样品处理和灵活性方面具有优势。

验证研究

使用抗SARS-CoV-2免疫球蛋白的首个世界卫生组织（WHO）国际标准品和作为二级标准品的临床血浆样本对该测定法进行了验证。对于野生型SARS-CoV-2，世界卫生组织参比试剂获得的NT50值与PRNT相当。一组包含低、中和高中和剂的12个二级标准品显示出两种试验之间具有良好的相关性。

通过测定板内（重复性）和板间（中间精密度）变异性的严格重现性研究表明，变异系数低于血清中和试验的可接受阈值。在190份恢复期血浆样本中，检出的NT50值从1至超过5000，动态范围较宽。

重要的是，该试验可以检测到β变种的中度免疫逃逸和Omicron BA.5与野生型的显著逃逸，这与已发表的数据一致。针对关注变种信号的减少为随时间变化的群体免疫力提供了见解。

临床研究应用

考虑到流式细胞仪分析的重现性和通量，该微量中和试验非常适合在大型临床研究中定量中和抗体应答。以下是其在支持疫苗和治疗开发方面的一些应用示例：

• 通过测量接种后NT50水平确定临床疫苗试验中保护作用的相关性。中和水平与疫苗有效性直接相关。
• 通过感染或接种后NT50随时间的纵向队列监测确定保护性免疫的持续时间。
• 快速筛查，以确定恢复期血浆或单克隆抗体研究中中和能力最高的血浆供体。
• 表征对新变体的免疫应答减弱，以指导加强疫苗株选择和时间表。
• 在异源初免-加强试验中比较不同疫苗接种方案后的免疫应答。

总之，与传统的PRNT相比，这种基于流式细胞术的新型微量中和试验为SARS-CoV-2中和研究提供了一种可重现、定量和高通量的方法。平行检测多种毒株的灵活性使其非常适合应对不断变化的流行病学和评估大流行演变过程中的新候选疫苗。通过标准化免疫相关性评估，广泛采用有助于加速临床研究进展。

参考文献：O'Reilly S, Kenny G, Alrawahneh T, et al. Development of a novel medium throughput flow-cytometry based micro-neutralisation test for SARS-CoV-2 with applications in clinical vaccine trials and antibody screening. PLoS One. 2023;18(11):e0294262. Published 2023 Nov 30. doi:10.1371/journal.pone.0294262