人外周血PBMC提取后CD4+T细胞消失

celia

想请教一下各位大佬。

最近在做外周血PBMC的流式。方法是使用Ficoll密度梯度离心后吸取白膜层。Ficoll和血样恢复至室温，血样也进行了稀释，使用的是水平离心机。离心后白膜层还是比较明显的。
第一次做的时候CD3+(FITC)阳性54%左右，CD8+(Percp-Cy5.5，不是图例中的PE-Cy5)23%左右，但样本管和单染管形态histogram形态似乎有点奇怪（如图）。并且，相对于空白管，CD4+阳性比例为0。
第二次做的时候CD3+阳性比例48%左右，CD8+比例19%左右与，但形态看起来还是有很多峰。CD4+阳性比例也是0。
第三次做的时候将原本CD4的BV421荧光换成了APC-Cy7，只做了CD4+的单染，用空白对照画门，CD4阳性比例大约为5%（和既往文献报道不符）。

空白管画门后单染管

空白管画门后样本管

请问下各位大佬，可能的原因是什么呢？后续有何排查问题的方法？

615825824

我也出现了标记不出CD4的问题，但我很确定我的样本是一定有CD4的，有人能解答一下吗

wxd

可以先打电话给抗体厂家或供应商，问问是不是抗体有问题，因为CD8染上了，证明实验操作没问题。如果外周血是买的，问问供应商是不是外周血有问题，理由同上。
我们来解答的话，也是这两个方向：
抗体有问题，换一个克隆号/品牌的抗体试试；
PBMC或者制备PBMC的步骤有问题，试试裂红法或者换一个样品试试；
还有一种说法是：CD4会内化，染色需要对样品进行固定和破膜。不过我没找到CD4内化的相关文献，只是在论坛里见有人提过。也可以试试。

飞翔

PBMC直接做，是正常人的样本吗？CD4的抗体用过吗，确认好用吗？之前遇到过抗体荧光不对的

celia

wxd 发表于 2024-1-31 11:09
可以先打电话给抗体厂家或供应商，问问是不是抗体有问题，因为CD8染上了，证明实验操作没问题。如果外周血 ...

谢谢老师！