使用流式细胞仪 检测磁珠 出现奇怪分群

zhfge

我最近在尝试使用磁珠捕获微囊泡后，使用流式进行分析。但是碰到一个问题不知道怎么解释，希望各位老师能帮忙解惑。

我是使用粒径3μm的磁珠，包被了捕获抗体，结果上仪器就发现磁珠会聚集成很有规律、按对角线排列的不同群；这个现象在对样本进行捕获后会更明显一些。除此之外，我用了不同的流式细胞仪，发现使用Thermofisher 的Atune时，这种现象比Beckman的Cytoflex更明显。




开始的时候我猜测可能是磁珠形成了类似细胞的粘连体，但是按照FCS-A：FCS-H方式处理数据后，这些分群还是存在的
我的疑问是，我想即使是磁珠聚集成团块了，那在FSC-A上/SSC-A上也该是二聚体、三聚体、N聚体连续出现，为什么会有这种明显的分群呢？问了赛默飞的技术支持，也说不出个道理来。

niwanmao

1、各群体比例分别多少？
2、试过用最慢的速度获取吗？

zhfge

niwanmao 发表于 2024-1-9 17:04
1、各群体比例分别多少？
2、试过用最慢的速度获取吗？

1、各群体比例分别多少？
不同实验批次的差异很大，比如下面这批，R1（最小的群)就是10%+的水平；有时候能到50%+的水平。不进行任何捕获，R1最高可以到80%+。



2、试过用最慢的速度获取吗

试过。我现在一般是按照25μL/min的流速上样，这种流速跟Atune最低流速(12.5μL/min)的表现差异不大。目前控制在800events/s以下，一般在300~500events/s。也试过更高流速，会发现FSC/SSC整体会变大而且分辨不开。大流速下很多就会直接聚成一大群。

niwanmao

zhfge 发表于 2024-1-10 10:11
1、各群体比例分别多少？
不同实验批次的差异很大，比如下面这批，R1（最小的群)就是10%+的水平；有时候 ...

我觉得有两方面因素：
1、仪器的液路是首要问题所在，先彻底清洗一下，甚至更换。
2、微球的均一性，有必要确认一下

zhfge

niwanmao 发表于 2024-1-10 11:23
我觉得有两方面因素：
1、仪器的液路是首要问题所在，先彻底清洗一下，甚至更换。
2、微球的均一性，有必 ...

我觉得有两方面因素：
1、仪器的液路是首要问题所在，先彻底清洗一下，甚至更换。
我们经常使用仪器自带的deep clean功能来清洗，我们本身做细胞外囊泡特别是大囊泡，也怕有污染；但洗完也没见到有改善。这样洗涤可以嘛？

2、微球的均一性，有必要确认一下

这个我还真拍过好几次电镜看过，确实存在磁珠粘连，但没有流式上表现的这么夸张，大多数还都是单个球。

niwanmao

zhfge 发表于 2024-1-10 12:56
我觉得有两方面因素：
1、仪器的液路是首要问题所在，先彻底清洗一下，甚至更换。
我们经常使用仪器自带 ...

液路如果洗涤无改善，说明洗涤的方法有问题，可请工程师来处理一下

微球的均一性，不是说的粘连，而是微球本身的尺寸

hannotech

一般厂家磁珠的直径均一性都不是太好，定购前必须要指定用于流式应用。

zhfge

我们用过几个品牌的磁珠，我们自己都拍过电镜，看上去粒径觉得还行。
下面这个图是3μm磁珠，最近实验结果里随手找的。里面有看到大粒径磁珠的污染，比例很低，不知道是哪里的污染，不过按这个比例应该跟这个现象无关。

niwanmao

zhfge 发表于 2024-1-15 09:34
我们用过几个品牌的磁珠，我们自己都拍过电镜，看上去粒径觉得还行。
下面这个图是3μm磁珠，最近实验结果 ...

这只是一个视野，有污染就很危险了

所以我的意思是：
1、液路污染
2、微球本身污染

这两者可能综合在一起，造成你这样的图形

JindongLi

没有包被抗体前的磁珠测试过没