细胞凋亡实验，显微镜和流式的结果不一致

wmj123456

药物处理细胞，用Annexin V/PI检测。在显微镜下观察，细胞出现皱缩，看到了比较多的凋亡细胞，但是流式检测，没有预期的凋亡的比例，跟对照组的比例接近。另外一组药物处理组，显微镜下的凋亡情况和流式的结果比较吻合。

请教各位老师，这种情况该怎么解释？

niwanmao

显微镜下的形态，会跟蛮多因素有关吧，我觉得主要是确保染色良好，那么结果就可信的

wxd

细胞皱缩不一定是凋亡，也可能只是状态不好。另外流式你用的是Annexin V/PI检测，与之对应的显微观察，就不能只从形态学来判断，应该也用Annexin V/PI或者Calcein/PI染色后用荧光显微镜/激光共聚焦显微镜观察才能得到相匹配的结果。另外，由于流式相比于显微观察多了胰酶消化和清洗的步骤，所以两个实验结果可能不是严格对应的，在实践中只要趋势一致就行了。

wmj123456

wxd 发表于 2024-1-15 09:03
细胞皱缩不一定是凋亡，也可能只是状态不好。另外流式你用的是Annexin V/PI检测，与之对应的显微观察，就不 ...

您好，请问下，细胞转染的BFP荧光蛋白，显微镜观察有60%的转染效率，但是流式检测，在样本管根据阴阳性分群，阳性的有8%左右，这种情况该怎么解释？
我的理解是，是否显微镜观察到60%细胞都是蓝色，不是均匀分布的，正好是看的那个视野蓝色的多？另外是肉眼观察，也存在细胞散射产生的蓝色？

wxd

有细胞分布不均匀和细胞散射的因素在内。但从60%降到8%这个差距太大了，应该不止这几个因素。我个人猜测可能得因素有：
1.显微镜观察时只进行了肉眼观察，没有通过未转染细胞设置拍摄参数来拍摄转染细胞，或者参数设置不合适，导致显微镜观察结果偏高。解决方法是：以未转染细胞没有荧光的最大拍摄参数来拍摄转染细胞，排除背景荧光的同时获得最大的灵敏度。
2.转染细胞不耐受消化，导致显微镜下观察到的大部分转染细胞在消化过程中破碎；这个可以看一下流式检测结果中对照组和样品组的细胞数量和细胞碎片的比例来确定一下。解决办法是弃用流式检测结果，通过未转染细胞组设置拍摄参数，拍摄转染结果并用ImageJ分析得到统计学数据。

wmj123456

wxd 发表于 2024-4-29 08:44
有细胞分布不均匀和细胞散射的因素在内。但从60%降到8%这个差距太大了，应该不止这几个因素。我个人猜测可 ...

是打算用流式方法做的，目前怀疑流式结果的准确性。。。。前辈，有没有这种说法，流式仪器的激光器功率高，可能会导致BFP的荧光发生淬灭？所以流式上的比例低？

wxd

没有听过这个说法。
根据我查的资料，荧光显微镜的光源功率通常是1-10瓦特（W）；而流式细胞仪的激光器功率通常是25-150mW。所以荧光显微镜的激发光源功率更高一些。即便是激光共聚焦显微镜，其激光器功率通常是μW级的，但生命科学的激光共聚焦通常是单针孔扫描式的，单位面积上的激光功率也是要比流式细胞仪高的。
而且细胞在流式细胞仪上通过激光光路的时间要远短于在显微镜激光光路下暴露的时间，如果显微镜下观察没有问题，流式的激光器荧光不至于将荧光淬灭。

wmj123456

wxd 发表于 2024-4-29 17:04
没有听过这个说法。
根据我查的资料，荧光显微镜的光源功率通常是1-10瓦特（W）；而流式细胞仪的激光器功率 ...

我说错了，是荧光显微镜的功率高，本来是考虑是否是细胞在荧光显微镜下面照射久了，荧光淬灭，所以在流式上阳性比例不高。我准备再重复下实验。谢谢前辈啊。
另外，我想问问，如果转染的某荧光蛋白，我想做个阴性设门对照，是否可以这样设置，细胞跟转染的细胞走一样的流程，不过对照组只加转染试剂，不加质粒？

wxd

建议转染个空质粒进去。毕竟转染质粒这一步，无论是否带目标基因，都会对细胞产生比较大的影响。