新手第一次做人外周血CD4+CD25+FOXP3+调节T细胞求助

冯宗波

我是新手第一次做treg，标本为人外周血做成了PBMC，不太清楚这个图问题在哪，希望得到帮助，谢谢！！！！

niwanmao

是否可以讲一下你所用的固定、破膜剂，以及操作步骤？

冯宗波

niwanmao 发表于 2024-1-24 20:54
是否可以讲一下你所用的固定、破膜剂，以及操作步骤？

5.        固定透膜：每管加入 400 µl 核内固定液，移液枪轻轻吹打混匀， 室温避光孵育 1 h。每管加入 1 ml 核内洗液， 轻轻吹打混匀， 2000rpm 离心 10 min， 弃上清。
6.        加核内染色抗体：加入 Brilliant Violet 421™ anti-human FOXP3 Antibody 原液 5 µl，同型对照管加入同型抗体，室温避光孵育 1 h。每管加入 1 ml 核内洗液， 轻轻吹打混匀， 2000 rpm 离心 10 min， 弃上清。
7.        每管加入 200 µl 1×PBS， 混匀后进行流式上机检测。



固定破膜剂为True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set，biolegend公司的

我是超人我怕啥

冯宗波 发表于 2024-1-24 21:04
5.        固定透膜：每管加入 400 µl 核内固定液，移液枪轻轻吹打混匀， 室温避光孵育 1 h。每管加入 1 ml 核 ...

倪老师应该是想问用得什么品牌的，固定破膜

冯宗波

我是超人我怕啥 发表于 2024-1-25 10:26
倪老师应该是想问用得什么品牌的，固定破膜

最后面我写了，固定破膜剂为True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set，biolegend公司的

vtea

冯宗波 发表于 2024-1-24 21:04
5.        固定透膜：每管加入 400 µl 核内固定液，移液枪轻轻吹打混匀， 室温避光孵育 1 h。每管加入 1 ml 核 ...

你这个步骤5只加固定液后洗涤，破膜液后面有么有加？还有上机细胞收了多少

ccx793244586

您的固定破核时长1h会不会太长了，虽然官网的说明书没有给出推荐时间，不过这类试剂盒一般都是推荐4度30min吧。然后BV510对BV421的补偿不小，另外排除操作以及流式的电压和补偿调节，PBMC中Treg的比例受供者状态的影响，如果是未患病的个体，Treg比例低也是正常的，不过您这个看上去CD25+跟Foxp3+双阳性的位置是基本没有的。

niwanmao

冯宗波 发表于 2024-1-24 21:04
5.        固定透膜：每管加入 400 µl 核内固定液，移液枪轻轻吹打混匀， 室温避光孵育 1 h。每管加入 1 ml 核 ...

按照说明书，似乎不是这样的步骤：

Perform cell surface staining as described in BioLegend's Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol.

Add 1mL of the True-Nuclear™ 1X Fix Concentrate to each tube, vortex and incubate at room temperature in the dark for 45-60 minutes.

If necessary, the protocol can be suspended at this point. After discarding supernatant, re-suspend cells in CytoLast™ Buffer (Cat. No. 422501) or equivalent. Samples can be stored at 4°C for 12-18 hours, protected from light and plastic-wrapped to protect buffer evaporation.

Without washing, add 2mL of the True-Nuclear™ 1X Perm Buffer to each tube.

Centrifuge tubes at 300-400xg at room temperature for 5 minutes, and discard the supernatant.

Add 2mL of the True-Nuclear™ 1X Perm Buffer to each tube.

Centrifuge tubes at 300-400xg at room temperature for 5 minutes, and discard the supernatant.

Resuspend the cell pellet in 100µL of the True-Nuclear™ 1X Perm Buffer.

Add the appropriate amount of fluorochrome conjugated antibody diluted in True-Nuclear™ 1X Perm Buffer for detection of intracellular antigen(s) to each well and incubate in the dark at room temperature for at least 30 minutes.

Add 2mL of the True-Nuclear™ 1X Perm Buffer to each tube.

Centrifuge tubes at 300-400 x g at room temperature for 5 minutes, and discard the supernatant.

Add 2mL of cell staining buffer (Cat. No. 420201).

Centrifuge tubes at 300-400xg at room temperature for 5 minutes, and discard the supernatant.

Resuspend in 0.5mL cell staining buffer then acquire the tubes on a flow cytometer.  

862789366

建议咨询的时候把信息写得详细一下，比如：
1. 实验目的
2. 方法（包括原理，使用的试剂等）
3. 实验操作过程有无异常
4. 结果及存在的问题
将上述信息简单进行描述，让更多的人参与进来，问题讨论的可能透彻些。

77flower

我们用ebioscience的比较多，而且效果好，比较稳定，biolegend的东西每次用都紧张