关于CD4标记

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老师您好。

我最近的实验 实验九抗原刺激过够的CD4 T 细胞相关表型及功能。 但流式结果很诡异：CD4用APCcy7标记。 经常出现CD4完全标不出来的情况。但他又不是每一个都标不出来 有的又能标出来。我知道PMA刺激的话可能引起CD4内吞，不过我并不是PMA抗原，并且甚至我的空白孔，无抗原刺激的孔也标不出来。     而且更诡异的是，还出现了同一份标本不同的孔，有的标出来有的标不出来的问题（除1微升加入的试剂不同外其余条件相同）。

我自己也尝试去找原因，对于没标出来的样本重新再加一次，依旧标不出来。而且这种情况出现了很多次，基本排除操作失误没有加上抗体的情况。而且CD4标不出来的标本，CD45RA也标不出来。
我的实验是会破膜的，这个破膜对CD4和CD45RA的标记有影响呢？ 但还是那个情况，并不是所有人都标记失败，也有成功的，甚至同一个人的样本也有成功失败的。所以现在十分迷茫究竟是哪一步出了问题 老师能麻烦帮我分析下原因吗？

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补充：虽然分的不是很开 单后续的分析是完全没问题的 该圈的门都能圈上，但如果CD4没有任何表达 那后续就没法儿看了

Yuck

你还是把操作步骤说一下吧，让大家看看你基本排除操作的对不对

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步骤简单来讲，第一步，差速离心法提取外周血PBMC，而后将PMBC种在96孔板，体系200ul，包含培养基和相关抗原，在培养初始便加入了趋化因子相关的流式抗体（过夜后标不出来）以及BFA，刺激16h后拿出来，先直接标记表面蛋白相关流式抗体，再破膜标记胞内细胞因子。最后的结果里，除了CD4和CD45RA，其余的胞内或表面都标记出来了。
现在我怀疑是因为最初有些病人肝素样本太少便混入了一些EDTA和枸橼酸钠抗凝的血，可能是这个原因。正在做不混样本的实验验证，如果明日结果 所有不混样的都能标出来就基本可以确定是抗凝剂的问题。

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Yuck 发表于 2024-1-30 13:34
你还是把操作步骤说一下吧，让大家看看你基本排除操作的对不对

所以步骤上应该没有太大问题

zdvfsadb

有没有可能是抗体本身的问题？虽然概率有点低

Yuck

zdvfsadb 发表于 2024-1-31 03:20
有没有可能是抗体本身的问题？虽然概率有点低

这个好验证，直接拿原pbmc染一下看看有没有表型就行。你用的相关抗原刺激是不是有CD4，导致染抗体时候表位被占了？

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Yuck 发表于 2024-1-31 09:18
这个好验证，直接拿原pbmc染一下看看有没有表型就行。你用的相关抗原刺激是不是有CD4，导致染抗体时候表 ...

抗体是BD的，我们医院临床项目都是用的这支抗体，应该不会是抗体本身原因。 并且同批样本中也有一部分样本CD4是能标出来的 所以抗体本身应该没问题

Fish形影单只

有些刺激剂会诱发细胞表面CD4分子被内吞。你可以试试用CD3和CD8反圈门。