BrdU染色问题

司徒随风

最近做anti  BrdU染色看增殖，使用的是U266细胞，复苏后传代一次，养24h后，补充5mL含有BrdU的培养基（BrdU终浓度50uM）,37℃，5%CO2孵育1h，取细胞，离心，弃上清，使用eBioscience™ Foxp3 固定破膜，再使用anti  BrdU-FITC染色，做了四个浓度，分别是5,1,0.5,0.1ul。结果如下https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MjU5MTV8MWY2MDhjYjF8MTc0MDI1NzkwNHwwfA%3D%3D，看这个结果我们也不太确定到底有没有染上，希望有大佬能不吝赐教，

目前我们还在初步探索阶段，因此还没有加RNA酶

。

司徒随风

谢谢各位大佬

niwanmao

你考虑一下选一个增殖强的样本，将BrdU和PI一起染，看S期和G2/M的的BrdU分布，可确认是否好的

司徒随风

niwanmao 发表于 2024-2-2 15:30
你考虑一下选一个增殖强的样本，将BrdU和PI一起染，看S期和G2/M的的BrdU分布，可确认是否好的 ...

请问倪老师，PI也是破膜后染吗

niwanmao

司徒随风 发表于 2024-2-2 17:35
请问倪老师，PI也是破膜后染吗

是的，染倍体

congou

如果不做其他marker染色的，可以用酒精固定 2N盐酸处理后，染BrdU。

司徒随风

niwanmao 发表于 2024-2-3 18:49
是的，染倍体

好的，谢谢老师，我试试看。

司徒随风

congou 发表于 2024-2-5 09:35
如果不做其他marker染色的，可以用酒精固定 2N盐酸处理后，染BrdU。

好的，谢谢大佬，改天我试试看

司徒随风

各位老师好，最近又重复了一次，感觉好像是有点染上了

• 取提前孵育好的细胞，并计数。
• 在4°C、冰冷70％v/v乙醇中悬浮至少30分钟，固定和沉淀细胞（这样处理之后，最多可保存7天）。
• 离心去上清，用PBS洗涤一次后，在室温下与新鲜用纯水配制的2M HCl孵育30分钟（偶尔混合一下）。
• 用PBS洗涤细胞两次，然后用PBS-吐温（PBS，含0.1％w/v BSA和0.2％v/v Tween 20，pH 7.4）重悬。
• 将适量抗BrdU抗体添加至细胞悬液中，并在室温下避光孵育10分钟。（一定要注意避光，BrdU是光不稳定的）。
• 用PBS-吐温洗涤样品两次
• 上机，每个样本至少收集20000个颗粒
  

司徒随风

司徒随风 发表于 2024-2-29 10:59
各位老师好，最近又重复了一次，感觉好像是有点染上了

取提前孵育好的细胞，并计数。

倪老师好，请问一下这个是染上了吧