TNFa和IFN检测异常

司徒随风

试验方法：

1、无菌取小黑鼠脾，制备单细胞悬液，并计数；

2、使用PBMC完全培养基将细胞密度调整到10M/mL；

3、每1mL配制好的细胞，用10mL含有PMA（50 ng/ml），Brefeldin A（1 μg/mL） 和离子霉素（1μg/ml）的PBMC完全培养基，在10CM培养皿培养5h；

4、孵育完成后将细胞转移到15mL离心管中，500g离心5min弃上清；

5、加入10mL的2%FBS重悬细胞，500g离心5min弃上清；

6、加入适量的1×PBS重悬细胞，并计数，以供后续染色试验。

7、调整细胞密度为10M/mL，按1M/孔细胞点样，每孔先染胞外Maker，清洗两遍，

8、使用eBioscience™ Foxp3 固定破膜，再染TNFa或IFN（目前我们做4个浓度，分别是5ul/test和1ul/test,0.5ul/test,0.1ul/test）

https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MjU5MjF8ZGMzODliN2R8MTczMzMwMjE4M3wwfA%3D%3D

niwanmao

从步骤看起来没啥大问题，但是IFN的结果为啥CD4+T细胞没有一点阳性？这是有点奇怪的地方

至于TNF的结果，只看到一个浓度的图，其它三个浓度的图如何？

司徒随风

这个是原始数据和TNF a的其他几个浓度

niwanmao

司徒随风 发表于 2024-2-6 09:25
这个是原始数据和TNF a的其他几个浓度

大致看了见眼原始数据，感觉有点怪的，是否在foxP3固定破膜剂的使用步骤上面，再想办法优化一下

司徒随风

niwanmao 发表于 2024-2-6 11:18
大致看了见眼原始数据，感觉有点怪的，是否在foxP3固定破膜剂的使用步骤上面，再想办法优化一下 ...

我们的破膜操作：
1.制备单细胞悬液。
2.每孔加入200 µL Foxp3固定/破膜工作溶液。吹打混匀。
3.室温 避光孵育30分钟。
4.在室温500 x g 离心样品5分钟。 弃上清。
5.每孔加入200 µL 1X破膜液，在室温下500 x g 离心样品5分钟。 弃上清。
6.重复第7步。
7.在剩余体积中重悬沉淀，用1X破膜液将体积调节至约100 μL。
8.加入配制好的抗体，并在室温下避光孵育30分钟。
9.每孔加入200 µL 1X破膜液，在室温下400-600 x g 离心样品5分钟。 弃上清。
10.重复第12步。
11.将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。
12.通过流式细胞术分析。
试剂配制方法：
Foxp3固定/破膜液：将1份Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate与3份Foxp3 Fixation/Permeabilization Diluent混匀。
1X破膜清洗液：将1份10X Permeabilization Buffer与9份蒸馏水混合。