检测线粒体膜电位

幸运女神

检测THP-1细胞的线粒体膜电位，使用碧云天的JC-1试剂盒，用flowjo分析，补偿也调了，但是无法调出像文献那样向下拖尾的图，是什么原因呢？我的实验用是六孔板，每孔100万个细胞这样，每孔500ul培养基+500ulJC-1工作液（按照每5µl JC-1 (200X)加入1ml JC-1染色缓冲液的比例配制的工作液）, 孵育20min。但是实验结果似乎是没有分出线粒体膜电位正常和线粒体膜电位下降的两个组，都是聚在一起的一团。是实验步骤的原因，还是我不懂分析呢？希望有好心人帮忙解答，已经做了两三个月了，还是做不出来，希望大佬们帮忙解答，谢谢大家！

niwanmao

看了下说明书，似乎跟你这里有所不同，你是否对照着再重复看看？

对于悬浮细胞：
a.取10-60万细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
b.加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。
c.在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。
d.37℃孵育结束后，600g 4℃离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
e.用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次：加入1ml JC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g 4℃离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1ml JC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g 4℃离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。
f.再用适量JC-1染色缓冲液(1X)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

PS：发帖请选择提问版块，此次先帮你转移过去：
1、基础问题（如仪器、原理、试剂耗材、软件等）
2、临床检测方面（如免疫分型、淋巴细胞亚群等）
3、科研方面（如周期、凋亡、线粒体、DC、巨噬等）
4、流式分选和磁珠分选

tiger

两个方面要注意一下，一是把主群左边的细胞也圈上，二是在收集细胞时悬浮的细胞也要一起收集。

幸运女神

niwanmao 发表于 2024-3-5 08:18
看了下说明书，似乎跟你这里有所不同，你是否对照着再重复看看？

老师，我用的是增强型的线粒体检测试剂，它的操作说明是这样的
对于悬浮细胞：
a. 取10-60万细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
b. 加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37ºC孵育20分钟。
c. 37ºC孵育结束后，600g 4ºC离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
d. 用JC-1染色缓冲液洗涤2次：加入1ml JC-1染色缓冲液重悬细胞，600g 4ºC离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1ml JC-1
染色缓冲液重悬细胞，600g 4ºC离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。
e. 再用适量JC-1染色缓冲液重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪
分析。

幸运女神

tiger 发表于 2024-3-5 09:13
两个方面要注意一下，一是把主群左边的细胞也圈上，二是在收集细胞时悬浮的细胞也要一起收集。 ...

老师，我的就是悬浮细胞，都是从六孔板上收集的，孵育完也全部离心了

tiger

幸运女神 发表于 2024-3-5 09:28
老师，我的就是悬浮细胞，都是从六孔板上收集的，孵育完也全部离心了

是我搞错了，但主群左侧的那些细胞一般都是坏死或凋亡的细胞，你圈上后看看。