流式细胞术助力植物表观遗传学研究，揭示植物如何在不动声色中适应环境

niwanmao

植物虽然不能动，但进化出错综复杂的机制，从而在多样化和不断变化的环境中适应和茁壮成长。其中一个机制是在不改变 DNA 序列本身的情况下，发生表观遗传学-基因表达的可遗传变化。

下图展示了环境压力如何影响植物的基因单元（核小体、染色体和紧密染色质），从而引起植物的表观遗传变化，如组蛋白修饰、DNA甲基化和RNA干扰，这些变化会导致基因的沉默或激活，从而使植物适应或耐受环境。其中，组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化等，DNA甲基化是通过添加甲基基团来改变DNA序列，RNA干扰是通过小RNA分子来调节基因表达。这些表观遗传变化会影响细胞功能和染色体结构，从而影响基因的表达和植物的适应性和耐受性。


1、DNA甲基化分析
流式细胞术（FCM）是一种在细胞层面上有效测量DNA甲基化水平的技术，原理是通过分析被5-甲基胞嘧啶（5mC）等特定DNA甲基化标记物的抗体标记的细胞所发出的荧光强度。尽管在植物DNA甲基化的检测中，流式细胞术面临一些挑战，例如背景荧光的干扰和固定过程中可能导致的细胞核聚集，但通过精心调整实验条件，这种方法在植物生物学中的应用前景仍然充满希望。为了适应不同的细胞类型和物种，固定缓冲液和时间需要标准化。

有一种简化的方法是使用未固定的细胞核进行免疫标记，这种方法避免了传统免疫荧光技术中多次洗涤的步骤，已经在动物细胞研究中得到验证。以洋葱叶组织为例，通过使用抗5-甲基胞嘧啶抗体来测量平均荧光强度，可以作为评估甲基化水平的指标。在测试的缓冲液中，LB01缓冲液因其高核产率和低背景而脱颖而出。通过盐酸处理保持染色质的变性，以确保DNA荧光水平的稳定性和峰值变异系数的降低。这种方法在检测洋葱叶组织中由5-氮杂胞苷引起的DNA低甲基化方面显示出了有效性。

流式细胞术作为一种分析工具，具有高敏感性，能够检测到由不同处理引起的甲基化水平的微小变化，并且只需要少量的组织样本，适合于研究不同组织类型、发育阶段和应激反应中的甲基化动态。

此外，流式细胞术还能通过PI荧光强度区分细胞周期的不同阶段，为细胞异质性提供额外信息。

从实用角度来看，流式细胞术以其简便、快速和经济高效的特点而受到青睐。

2、组蛋白修饰分析
组蛋白修饰对DNA的紧密打包和转录活性产生影响，并在基因调控、细胞分化和发育等众多生物学过程中发挥作用。

EpiTOF（通过飞行时间的细胞术进行表观遗传景观分析）是一个高效的平台，允许在单细胞水平上，通过大量细胞分析，全面了解组蛋白修饰的状态。结合了质谱和流式细胞术的EpiTOF技术，能够同时分析组蛋白修饰和其他生物学指标。目前可研究多种组蛋白修饰的表观遗传标记，如H3K4me3、H3K9me2、H3K36me3和H4K20me1等。

3、染色质可及性研究
为了确保在无细胞质的环境中能够释放出足够数量且完整的细胞核，并保护它们免受核酸内切酶的侵害，同时便于DNA的染色，选择合适的分离缓冲液至关重要。

氯化镁和硫酸镁缓冲液中的镁离子有助于稳定核染色质，而多胺缓冲液中的精胺同样能够起到这一作用。还原剂如β-巯基乙醇和二硫代苏糖醇不仅能够保护染色质蛋白，还能防止酚类化合物对DNA染色的干扰。在核分离过程中，将细胞核置于如Otto I缓冲液等合适的缓冲液中，其中含有柠檬酸，这不仅固定了细胞核，还增加了染色剂的接触面积。在染色阶段，碘化丙啶作为染料与DNA结合，柠檬酸处理可能增强了染色质的可及性，使染色质结构均质化，从而使得染色剂更容易渗透细胞核并与DNA结合。这种处理在大多数植物物种中能够产生高分辨率的DNA含量图谱。

单细胞ATAC-seq技术以其高精度，成为研究植物细胞染色质景观和揭示染色质区域间复杂相互作用的重要工具。其能够与基于抗体的方法结合，通过流式分选（FACS）等技术，同时分析染色质的可及性并富集特定细胞群。该技术可分析每个样本中的500至1000个细胞核，涉及细胞核分离、流动分选、转位、文库扩增、测序和数据分析等多个步骤，为研究人员提供了单细胞水平上染色质可及性的详细情况。为了有效处理和解读数据，需要使用流式细胞仪、高通量测序仪、微流体装置和生物信息学软件等专业工具。

4、高通量数据采集能力
流式细胞术获得的测量结果的质量取决于核分离程序、使用的缓冲液和植物材料的质量。此外，叶组织可以作为植物材料的主要来源，因为很容易获得。然而，在某些情况下，利用叶组织很难获得高质量的直方图。在这些情况下，花瓣被用作植物材料的替代来源。花瓣是一个很好的细胞核来源，因为很容易分离，每单位体积含有大量的细胞核。

在植物生物学中，高通量数据分析对于解释模式和揭示基本的表观遗传机制至关重要。在植物表观遗传学中，直方图、散点图和主成分分析(PCA)图是流式细胞术中用于高通量数据处理的几种可视化工具。

参考文献：Jyoti, T. P., Chandel, S., & Singh, R. (2024). Unveiling the epigenetic landscape of plants using flow cytometry approach. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology, 10.1002/cyto.a.24834. Advance online publication. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24834