7-AAD染色后有3个细胞群的问题请教

baron

各位老师好，请教一下，


用7-AAD染色后，样本出现了3个群，和之前的不一样（之前用7-AAD染色后出现2个群），


请教一下，为什么会出现3个群啊，还有，中间的这个群要不要圈在活细胞的门里啊，谢谢。

baron

本次的，

本次的

之前的，

之前的

图好像没传上去，再传一下。

蒙牛一头牛

1. 只圈中间那群细胞，看看它们在FSC/SSC里面的分布；
2. 大概率是活细胞

niwanmao

baron 发表于 2024-3-21 11:04
本次的，

如果染色效果差，是否可多重复几次？若能排除染色条件上的原因，也有可能跟楼上站友所述，不排除细胞状态不同导致的分群差异

baron

老师你好，中间的群圈门后，和全部细胞的FSC/SSC图来比较的看的话，是处在细胞碎片的





之前的图（2个群的）我也分析了一下，右边的群放到FSC/SSC上来看的话是细胞碎片，左边的群放到FSC/SSC上来看的话是细胞。










看起来本次的中间的群是细胞碎片。

而之前的图，细胞碎片是强阳性的。

再请教一下哈，为啥会本次的会有细胞碎片是7-AAD弱阳性的，而之前的细胞碎片都是7-AAD强阳性的？是因为前处理的时候什么操作导致的吗？

谢谢啊。

baron

niwanmao 发表于 2024-3-21 13:54
如果染色效果差，是否可多重复几次？若能排除染色条件上的原因，也有可能跟楼上站友所述，不排除细胞状态 ...

倪老师您好，我们的做法（之前的和这次的）都是用7-AAD和其他荧光抗体一起同时对样品在4度下染色30分钟的，然后离心再洗一次，最后用PBS重悬后上机分析的。

niwanmao

baron 发表于 2024-3-21 16:43
倪老师您好，我们的做法（之前的和这次的）都是用7-AAD和其他荧光抗体一起同时对样品在4度下染色30分钟的 ...

是不是有可能没有混匀？

不过辅助FSC/SSC看起来，弱阳这群也是算死细胞

baron

niwanmao 发表于 2024-3-21 16:59
是不是有可能没有混匀？

不过辅助FSC/SSC看起来，弱阳这群也是算死细胞

倪老师您好，我回顾了我这次的操作，

1. 我把细胞从液氮中拿出来后放37度水浴解冻的时间，比之前的水浴时间长了一点。

2. 细胞的袋子（密封的）先喷酒精消毒了一下，然后用干净的无尘布擦干；再然后用喷过酒精的剪刀（目测已经干了的）开口细胞袋，细胞流经开口处后倒在离心管里；然后再哪离心管里的细胞去做离心、染色、清洗、重悬。

您觉得会不会是因为这些操作，把一部分活的细胞给弄死了，因为是刚死的，细胞膜的通透性还不是很大，所以7-AAD染色后呈弱阳性？

niwanmao

baron 发表于 2024-3-22 09:07
倪老师您好，我回顾了我这次的操作，

1. 我把细胞从液氮中拿出来后放37度水浴解冻的时间，比之前的水浴 ...

不排除吧

baron

niwanmao 发表于 2024-3-22 09:19
不排除吧

好的，谢谢