细菌检测Annexin V需要裂解细胞壁吗

wmj123456

请问哪位老师有细菌检测Annexin V的经验？Annexin V是35kda的分子，不知道是否能够通过细胞壁？需要进行裂解么？

wxd

我们用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等进行过很多次验证（人为制备死细胞比例已知的样本，之后用不同的方法进行检测），发现Annexin V/PI是不能检测细菌凋亡的，甚至连细菌的死活比例检测都不对。因此我们认为所有用Annexin V/PI检测细菌凋亡的文献都不可信。
根据我之前的工作经验，比较可信检测细菌凋亡的方法是cFDA/PI，原理是5-cFDA SE会被活细菌的酶降解成CFSE，发出绿色荧光，凋亡的细菌降解能力低，荧光也会降低，这个方法在不同种属的细菌样品中的染色条件是需要验证的以及优化的，稍微麻烦一些。
微生物流式里边，检测细菌死活更多一些，用的方法一般是SYTO 9/PI或者SYTO 63/PI，这个方法适用于细菌培养液、真菌孢子、酵母、污泥等样品的检测，使用范围更广一些，结果更准确可靠一些。只是SYTO 9和SYTO 63都比较贵，100T的大概要4000-5000元。资金紧张的情况下，也有用SYBR Green I/PI进行检测的，但是这个在不同种属的细菌样品中的染色条件是需要验证的。
如果实验要求不高或者研究不需要特别精细的话，也有单独用SYBR Green I进行微生物绝对计数的，这个在海洋生物研究中特别常见，抗菌效果评估中也有不少。

wmj123456

wxd 发表于 2024-3-26 11:42
我们用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等进行过很多次验证（人为制备死细胞比例已知的样本，之后用不同的方法进行 ...

请问下，为何在Annexin V/PI中，细菌的死活比例也不对呢？
单独用PI检测细菌，也是种评估死活的方法吧

wxd

PI在染色细菌和动植物细胞时的工作浓度是不一样的。Annexin V/PI试剂盒中的PI工作浓度一般是1 ug/mL，而染色细菌，一般用10 ug/mL的PI终浓度。另外还有一个因素就是：相对于动植物细胞来说，细菌的体积太小了，很难和杂质区分开，所以在FSC/SSC坐标系中可能是没有明显的细胞群的，只能在荧光通道里看，这就要求有一个通用染料先将所有细菌染色，之后再进行分析。不巧的是，Annexin V没有这个能力。
用PI来评估细菌死活确实是可行的，但是要求样品中除了细菌之外没有其他和细菌难以区分的杂质。

wmj123456

wxd 发表于 2024-3-27 08:52
PI在染色细菌和动植物细胞时的工作浓度是不一样的。Annexin V/PI试剂盒中的PI工作浓度一般是1 ug/mL，而染 ...

是的，前提是需要通过SYBR-Green先把菌确认好。
前辈对于细菌流式很有经验，昨天我在论坛里发了个关于细菌检测2个疑问的话题，有时间了看看，提一些自己的建议吧，谢谢