细菌凋亡的流式检测及其挑战深度剖析

niwanmao

细胞凋亡，这一生命进程中不可或缺的受控细胞死亡形式，在多细胞生物的发育、组织形态构建以及对抗微生物感染等方面扮演着关键角色。随着科研领域的拓展，细胞凋亡现象已不再局限于多细胞生物，而是延伸至单细胞生物如原生动物、粘菌、酵母甚至细菌中。然而，将多细胞生物的凋亡概念简单移植到单细胞生物上，可能忽视了生物多样性的深层生物学机制，故对细胞凋亡在单细胞生物中的定义及其潜在益处的深入探讨显得尤为重要。

在科学研究中，检测细菌凋亡是一个细致而复杂的过程，要求精准测定细胞凋亡途径的激活状况。我们通常会关注细胞凋亡特有的标志性事件，如Caspase活性的上升或Bax蛋白的激活。在特定实验条件下，可以直接证明细菌凋亡途径的启动，进而确认细胞凋亡的发生。实践中，还会加用Caspase抑制剂来确认和验证细菌细胞凋亡。

然而，更为常见的是通过检测凋亡途径活动引发的后续效应，从而间接判断细菌凋亡。例如，通过TUNEL分析法检测因凋亡而导致的DNA双链断裂，以及检测细胞外膜上磷脂酰丝氨酸（PS）的翻转等替代指标，这些都是评估细菌凋亡的重要依据。

然而，尽管在细菌和哺乳动物细胞死亡过程中，某些检测结果可能表现出相似性，但这仅仅是替代指标，并不能确凿证明细菌凋亡的确切发生。譬如，Annexin V在哺乳动物细胞中可作为早期凋亡细胞的标志，但在细菌中，其与细菌结合的意义以及与细菌凋亡过程的关系并未明朗。此外，TUNEL方法虽然是检测DNA链断裂的有效工具，但在细菌微小的基因组中，是否能产生足够能被该方法识别的断裂片段仍存疑。

另一种常用的检测工具是荧光标记的Caspase底物，如FITC-Z-VD-FMK，它能与“凋亡”的细菌结合，但具体是否与其他细胞成分发生非特异性结合尚待进一步验证。

综上所述，尽管已经积累了关于细菌如何应对致死刺激的一些有价值的数据，并鉴定出可能影响其死亡方式的细菌基因，但在大肠杆菌等细菌中确立凋亡途径的存在，还需要通过进一步研究明确Annexin V结合、TUNEL阴性以及FITC-Z-VD-FMK吸收等检测结果与细菌凋亡的真实关系。

在细菌细胞死亡过程中，研究者们发现了一种被称为“类凋亡细胞死亡”的现象，尤其是在革兰氏阴性细菌中，其表现为膜完整性的丧失。尽管这种现象在某种程度上类似于哺乳动物细胞凋亡过程中线粒体外膜的破裂，但两者在生物学机制上存在着根本性差异，如Bax蛋白的插入和细胞色素c的释放等关键步骤在细菌中并不适用。


至于单细胞生物，包括细菌在内的细胞凋亡现象是否具有生物学意义上的益处，引发了广泛的讨论。理论上，一些观点认为，当面临资源竞争或病毒感染时，单细胞生物通过细胞凋亡机制，使部分个体自我牺牲，从而有利于其余个体的生存繁衍。然而，这一理论尚未得到充足的实证支持，尤其在细菌中，若存在类似哺乳动物细胞凋亡与坏死的区分，可能对宿主的抗菌反应产生重大影响。

在细菌中，mazEF毒素-抗毒素系统被视为一种潜在的“自杀模块”，在特定应激条件下，该系统可通过下调MazE表达，允许MazF蛋白杀死细胞，从而展示出一种可能的细菌内部“程序性死亡”机制。然而，要论证这一机制如何在单细胞生物中演变为一种适应性优势，还需要解决一系列问题，如带有自毁能力的突变如何在同种群中被筛选并稳定遗传，以及在混合种群中此类自杀系统如何克服“作弊者”优势等挑战。

简而言之，尽管细菌凋亡检测面临着众多技术挑战，科研人员正不断深化对此领域的认识，借助流式细胞术等多种先进检测手段，逐步揭示细菌细胞凋亡背后的精细调控机制及其对宿主系统和生命进化的重要性。然而，当前依然迫切需要更多的实验证据，以准确界定细菌凋亡的边界和特性，同时也需厘清单细胞生物凋亡对其种群及整体生态系统可能产生的深远影响。

参考文献：Häcker G. (2013). Is there, and should there be, apoptosis in bacteria?. Microbes and infection, 15(8-9), 640–644. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2013.05.005IF: 5.8 Q1

wxd站友在另一个帖子中的回复内容，值得我们大家学习：我们用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等进行过很多次验证（人为制备死细胞比例已知的样本，之后用不同的方法进行检测），发现Annexin V/PI是不能检测细菌凋亡的，甚至连细菌的死活比例检测都不对。因此我们认为所有用Annexin V/PI检测细菌凋亡的文献都不可信。
根据我之前的工作经验，比较可信检测细菌凋亡的方法是cFDA/PI，原理是5-cFDA SE会被活细菌的酶降解成CFSE，发出绿色荧光，凋亡的细菌降解能力低，荧光也会降低，这个方法在不同种属的细菌样品中的染色条件是需要验证的以及优化的，稍微麻烦一些。
微生物流式里边，检测细菌死活更多一些，用的方法一般是SYTO 9/PI或者SYTO 63/PI，这个方法适用于细菌培养液、真菌孢子、酵母、污泥等样品的检测，使用范围更广一些，结果更准确可靠一些。只是SYTO 9和SYTO 63都比较贵，100T的大概要4000-5000元。资金紧张的情况下，也有用SYBR Green I/PI进行检测的，但是这个在不同种属的细菌样品中的染色条件是需要验证的。
如果实验要求不高或者研究不需要特别精细的话，也有单独用SYBR Green I进行微生物绝对计数的，这个在海洋生物研究中特别常见，抗菌效果评估中也有不少