请教各位胞内染色步骤如何优化

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  流式小白请教大家一个问题，我们做人PBMC的胞内染色试过两种不同的方法，具体方法如下，第一种方法在上流式的时候能有1000-2000个/秒，第二种方法上流式的时候大概就200-400个/秒，目前是更倾向于选择第一种方法，但是在帖子里面又看到niwanmao老师说Ficoll分离法才是获取PBMC的方法。红细胞裂解是获取所有非红系细胞的方法，不是获取PBMC的方法。有很犹豫是不是应该选用第一种方法。
不知道各位大神有没有更好的建议，谢谢谢谢

第一种方法：全血放置过夜后，先刺激阻断后裂红

方法一

第二种方法先提取PBMC，完全培养基孵育过夜，第二天做

方法二

niwanmao

全血刺激？还是PBMC刺激？需要看你的研究方案和目的。
一般来说全血刺激法是可以用的，并不一定全都要提PBMC后再刺激，但是我看你的步骤里面，为什么一定要把全血放一个晚上再刺激呢？要知道，全血样本通常建议接收后4小时内刺激的，否则容易影响结果。

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niwanmao 发表于 2024-3-31 16:28
全血刺激？还是PBMC刺激？需要看你的研究方案和目的。
一般来说全血刺激法是可以用的，并不一定全都要提PBM ...

老师，谢谢您的回复，因为我们收的是病人的血样，而拿到样本的时间不确定，如果太晚可能需要做到凌晨，所以考虑的是统一放一晚上，第二天一早来处理。我们的目的是想看患者外周血Th1,Th2,Th1以及Treg的功能。

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niwanmao 发表于 2024-3-31 16:28
全血刺激？还是PBMC刺激？需要看你的研究方案和目的。
一般来说全血刺激法是可以用的，并不一定全都要提PBM ...

我们一共做三管，不需要刺激阻断的都是当天拿到样本，提PBMC之后就开始染色上机。

AAAAAjjj

1、做细胞因子染色，赛默飞有一款超好用的刺激剂加蛋白转运抑制剂的，你要做的这几个细胞因子一般来说刺激3.5~4h就可以做出来了；2、刺激细胞不需要放在96孔板里面进行刺激，可以直接在流式管或者Ep管里面刺激；3、做这几个T细胞亚型分析，个人认为直接红细胞裂解液裂红即可，节省很多实验时间。

句号

我也是做的病人的，做的treg及其亚群，也是遇到临床收样时间不定，时间不是很好规划，我是当天提取PBMC处理做到固定这一步（死活、封闭、表染、固定），固定后8小时（一般就是第二天早上）再开始破膜、核染，再最开始摸条件的时候发现foxp3的群会移动，就把所有抗体做了滴定，加上FC block封闭，移动也明显得到了改善，大概是2ml的血样，做了快200例，细胞量没有出现过问题，你们可以试试（转速给的500g 5min）

niwanmao

用户被占用 发表于 2024-3-31 16:46
老师，谢谢您的回复，因为我们收的是病人的血样，而拿到样本的时间不确定，如果太晚可能需要做到凌晨，所 ...

虽然说太晚，做实验不方便，但如果为了实验结果的准确性，确实只能熬夜的。我们以前做研究生的时候，也都是这么过来的，为了一个功能试验或药物试验准时收集细胞，都睡在实验室

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AAAAAjjj 发表于 2024-4-1 14:36
1、做细胞因子染色，赛默飞有一款超好用的刺激剂加蛋白转运抑制剂的，你要做的这几个细胞因子一般来说刺激3 ...

好的好的，谢谢你的建议，谢谢谢谢

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句号 发表于 2024-4-1 15:31
我也是做的病人的，做的treg及其亚群，也是遇到临床收样时间不定，时间不是很好规划，我是当天提取PBMC处理 ...

好嘞，谢谢你的建议，谢谢谢谢

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niwanmao 发表于 2024-4-2 09:22
虽然说太晚，做实验不方便，但如果为了实验结果的准确性，确实只能熬夜的。我们以前做研究生的时候，也都 ...

好的好的，谢谢老师，谢谢谢谢