PBMC培养

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各位老师有没有做过PBMC的体外培养啊？我开始做Treg的功能验证，但是出现一个很奇怪的现象就是我把冻存的PBMC复苏过后，很大一部分细胞都出现了贴壁（在之前做个染色，大部分都是淋巴细胞，单核细胞的比例不是很高），所以现在就很困惑到底是什么原因引起的啊？是因为提出来的单核细胞居多（和之前新鲜样本染色结果不符合）还是淋巴细胞出现了贴壁？但是淋巴细胞不是悬浮细胞么？为啥会出现贴壁呢？我在收集细胞的时候应该只收集上清液还是应该吹打把贴壁细胞也收集起来呢？恳请指导，谢谢！！！

niwanmao

复苏后、培养之前，有没有染色看一下细胞活力和细胞组成呢？

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倪老师，我目前还没有培养，只是复苏后放孵箱里稳定4小时后用来做流式，昨天做的时候基本上4/5的细胞都贴壁了，悬浮的细胞基本上都没啥了，我把贴壁的细胞轻轻吹打下来收集起来做，在做的过程中的感觉就是细胞的状态很不好，很容易黏连，在等待上机的时候就明显看到了细胞又聚集成团（表染后上机，未固定），我用100目的窗纱过筛了一次，大概等待了10分钟（调模板），最后四管中都差点堵住了仪器，拿出来都又是明显的聚集成团，又再次过筛了一次。贴壁吹打的细胞做出来的结果看起来并没有很明显的单核群，并且其中有一管FMO管形态和其他管不太一样，不知道是不是细胞状态太差了，搞不懂是为啥（图1是昨天染色的流式图（部分移动太明显，圈不了门的通道未展示））

htw981123

我也遇见了这个情况，培养的pbmc出现了严重的贴壁现象，而且聚团严重

niwanmao

句号 发表于 2024-4-2 13:36
倪老师，我目前还没有培养，只是复苏后放孵箱里稳定4小时后用来做流式，昨天做的时候基本上4/5的细胞都贴壁 ...

我前面的意思，就是在没培养之前，先染一下死活，确认一下细胞活力。

从你这里的描述看，应该是细胞都死了，所以都成贴壁样细胞

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倪老师，是复苏拿一点细胞后立即染死活看看他的状态么？但是我稳定4个小时以后再染色，那个时候加了死活，大概80%的细胞也是没染上色的呀？这不能理解为细胞还是活细胞么？另外不太理解的就是为啥细胞死了还贴壁啊？之前养贴壁细胞的时候，判断他死没死，就是看她漂起来没有，但是为啥淋巴细胞本身是个悬浮细胞，反而要死了还贴壁了呀？好难啊，想不通，求倪老师解惑

niwanmao

句号 发表于 2024-4-3 09:04
倪老师，是复苏拿一点细胞后立即染死活看看他的状态么？但是我稳定4个小时以后再染色，那个时候加了死活， ...

我在想，是粘的比较牢的贴壁状态吗？因为我觉得淋巴细胞死了之后，沉淀下去了是否造成贴壁的假象呢？

如果80％的活细胞，应该状态问题不大，那么接下来就是得确认细胞是否真贴壁？然后分析细胞组成了

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倪老师，不是那种贴的很劳的贴壁状态，轻轻吹打就起来了，细胞量比较多，就感觉是底部有一层细胞形成的膜。图1是FSC-A与SSC-A的一个图），图2是整个圈门逻辑图

niwanmao

句号 发表于 2024-4-3 12:17
倪老师，不是那种贴的很劳的贴壁状态，轻轻吹打就起来了，细胞量比较多，就感觉是底部有一层细胞形成的膜。 ...

如果只是落在底部而不是那种真正贴壁细胞状态，我还是感觉更像是细胞状态不好的表现，这些细胞可能还没达到死亡（因此FVD780是阴性的），但至少活力很差，无法形成平时成团悬浮的状态。

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那倪老师这种细胞做出来会影响结果不呀？我在做预实验的时候就是有的地方就是非常困惑，不知道是怎么一回事。就是我在用单染管建模版（冻存的PBMC），建好模版调整的时候就发现在单染管和AF647的FMO和全染管、其他FMO上的补偿不是很一致（AF647是间标，用的是Jackson的预吸附驴抗兔的二抗）（图1是我在单染管上调好补偿代入到其他管上的图），