c57小鼠外周血和脑组织th17检测

左眼皮

我最近在做小鼠外周血和脑组织的th17检测，用的是cd4-fitc和il17a-pe。
流式设计为：空染管，cd4单染管，il17同型对照单染管（调补偿用），cd4+il17同型对照，cd4+il17双染。
我所做的处理是酒精自由饮用90d。结果做出来非常的不理想，仅仅增加了百分之零点零几。不知道是手法问题还是本身就是这种生理状况。
有以下几个问题想要请教各位：
1.正常情况下，小鼠外周血，脑组织，脾脏th17的含量，就只有百分之零点零几吗？有没有哪位老师检测出来过？
2.我做出来，甚至是实验组，偶尔也会出现同型对照比icd4+il17多的情况。造成这种情况的原因有哪些呢？如何能够避免或者解决？
3.有老师做过fc受体阻断剂的th17 吗？是否也特别少？
4.科里其他师兄师姐用的是fc受体阻断剂加死活燃料，建议我也用，但他们做的不是th17；有一个做th17的师兄，他干脆舍弃同型对照和fc受体阻断剂，什么都不用。我想问一下，好一点儿的杂志对于这方面有这种要求吗？
5.我脑组织淋巴细胞就无法分群，用的是一个全脑，只能根据外周血淋巴细胞的位置类比进行圈门，主观性太强了，请问有没有什么解决办法？
以下分别是我外周血对照组和酒精组的流式结果图

外周血对照组

外周血酒精组

以下是脑组织对照组和酒精组流式结果图

脑组织对照组

脑组织酒精组

以下是脑组织三个对照组和三个酒精组的淋巴细胞不明显的分群以及自己圈门的方法

三个对照组和三个酒精组脑组织空染管，分群不明显

自己对于脑组织淋巴细胞的圈门

悬赏流星不多，麻烦各位老师了

niwanmao

从图形看，IL-17似乎没染出来，是否破膜操作上出了问题？

脑组织样本，无论从FSC/SSC还是染色分群结果CD4全阴，都提示细胞破碎或者样本状态差，结果不好

左眼皮

niwanmao 发表于 2024-4-9 10:52
从图形看，IL-17似乎没染出来，是否破膜操作上出了问题？

脑组织样本，无论从FSC/SSC还是染色分群结果CD4 ...

感谢老师的回复。我想问一下，外周血那个也没有染出来吗？我看他多了零点零几。细胞的状态我应该如何去判断或者区分呢？我要注意一些什么地方才能让细胞状态变好？

niwanmao

左眼皮 发表于 2024-4-9 15:09
感谢老师的回复。我想问一下，外周血那个也没有染出来吗？我看他多了零点零几。细胞的状态我应该如何去判 ...

在细胞破碎，或者细胞死亡的情况下，实验结果就应该作废，0.0几％的差距，没有意义。

细胞状态的判断，需通过核酸染料（如PI或7-AAD）或者活性胺染料。

使细胞状态变好，是需要从组织解离上先想办法，相关酶的优化配方参见：
最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
(出处: 流式中文网)

zdvfsadb

你在破膜前有用商品化的固定液固定吗？

左眼皮

zdvfsadb 发表于 2024-4-10 14:15
你在破膜前有用商品化的固定液固定吗？

有固定，就是3％-4％PFA固定15分钟，不是商品化的固定液。这个是商品化的更好是吗？

zdvfsadb

左眼皮 发表于 2024-4-13 16:56
有固定，就是3％-4％PFA固定15分钟，不是商品化的固定液。这个是商品化的更好是吗？ ...

我用BioLegend商品化的Fix Perm buffer套件感觉还挺好

左眼皮

zdvfsadb 发表于 2024-4-14 20:01
我用BioLegend商品化的Fix Perm buffer套件感觉还挺好

好的，谢谢

司徒随风

最近也准备做这个，从我目前了解的情况看，Th17好像静息状态下会非常少，目前我看到的都需要刺激，而且挺麻烦，祝楼主试验顺利，有啥进展能不吝分享一下。