flowjo分析周期

mangoo

各位老师好，我flwojo分析周期数据，图1FSC-SSC,图二去黏连SSCA-SSCH，图三PEA-PEH，图三中细胞团出现了3个，请问该怎么圈门呀

wxd

试试用FSC-A/FSC-H或者PE-A/PE-H来对正常培养细胞（对照组）圈门，然后看周期图。不断尝试圈不同的细胞群，看哪个跟标准的周期图比较像。

mangoo

老师你好，我的细胞转过绿色荧光病毒，然后我用的是PI做的周期，PE通道收的，收的时候没有调补偿，这个问题大不大呀？是否还需要重新铺板上机？

wxd

没超过检测限的话，问题不大，可以在收集完毕之后调整补偿。如果怕调整不好的话，可以只用转染后的细胞经固定后上机检测，作为单染管来调整补偿。
另外，做流式，最好在收集细胞前就设置好要画的门，并尽可能为后续分析留出余地。就细胞周期实验来说，可以画FSC/SSC门来排除细胞碎片，FSC-A/FSC-H来排除黏连细胞，PE-A/PE-H再排除一次。调整PE通道和PerCP通道的电压，之后收集PE-A/PE-H通道的单细胞15000个以上。这样在后续分析中就可以分别用PE和PerCP来分析结果。这两个通道的结果在绝大多数情况下是一致的，只是拟合度和统计结果的方差会有一些差异，根据情况挑好的结果用就行了。

Yuck

wxd 发表于 2024-4-22 17:40
没超过检测限的话，问题不大，可以在收集完毕之后调整补偿。如果怕调整不好的话，可以只用转染后的细胞经固 ...

细胞周期不去黏连会影响结果吗？是什么导致的有40%左右的黏连呢。PI染色核原理的话，黏连也算周期一部分吧？

wxd

不去粘连细胞的话，很影响实验结果。当两个单独的细胞因各种原因粘连在一起并被检测到，这两个细胞会被认为是G2/M期细胞，造成G2/M期细胞比例偏高。因为检测细胞周期主要是根据细胞内核酸的量来确定细胞所处的细胞周期，所以要尽量去除粘连的情况。至于你说的属于细胞周期一部分的粘连，应该说的是分裂后期的细胞，但正常的细胞周期，G0/G1期的时间是最长的，分裂期所占时间很短，分裂后期所占整个细胞周期的时间比例就更小了。因为未经细胞周期同步化处理的细胞，分裂基本属于随机，所以处于分裂后期的细胞所占整个群体的比例可以忽略不计。而在消化、固定等阶段产生的粘连细胞比例比较大，反而会严重影响分析结果，所以需要去除粘连细胞。

wmj123456

wxd 发表于 2024-4-22 17:40
没超过检测限的话，问题不大，可以在收集完毕之后调整补偿。如果怕调整不好的话，可以只用转染后的细胞经固 ...

老师，我想问下，如果细胞群体超出了仪器的检测范围，呈现一条线，把这群细胞圈门，实际上会影响这群细胞的比例吗？
譬如在展示CD45和SSC双参数时，有计数微球，微球在SSC上面成了一条线，这群微球代表真实的微球比例吗？我的理解是，如果调低ssc电压，让这群微球变得圆润，呈现完整的一群，那么比例是不会变化的。但是有种说法是，光饱和的时候，超出检测限的信号是测不到了，如果细胞呈现一条线，就说明是超出检测范围了

niwanmao

wmj123456 发表于 2024-4-30 11:28
老师，我想问下，如果细胞群体超出了仪器的检测范围，呈现一条线，把这群细胞圈门，实际上会影响这群细胞 ...

通常超限的信号，不建议纳入分析

wmj123456

niwanmao 发表于 2024-4-30 16:41
通常超限的信号，不建议纳入分析

倪老师，像我上面的红色框出的图，是理解为超限的了？

niwanmao

wmj123456 发表于 2024-4-30 16:55
倪老师，像我上面的红色框出的图，是理解为超限的了？

是的。超限的时候，不排除有些信号没有被收集，所以会存在错误的可能