大鼠全血刺激实验，什么刺激剂对于检测什么胞内细胞因子效果最好？

niwanmao

全血刺激实验
实验目的
- 评估不同浓度的刺激性试剂对大鼠全血中细胞因子产生的影响。

实验步骤
1. 血液采集：

• 从健康或经免疫抑制剂处理的SD大鼠采集外周静脉血。
• 使用含有干燥肝素的真空管收集血液。
  

2. 制备刺激溶液：

• 将PHA、LPS、Con A、PWM、PMA/ionomycin等刺激试剂用PBS稀释，并储存在-4°C。
  

3. 全血与刺激试剂混合：

• 将肝素化全血200 μL加入96孔板中。
• 添加不同浓度的刺激试剂（PMA: 1, 5, 和 25 ng/mL; Ionomycin: 1 μg/mL; PHA, LPS, Con A, PWM: 1, 5, 和 10 μg/mL）。
  

4. 孵育条件：

• 将加有刺激试剂的全血在37°C、5% CO2条件下孵育。
• 设定不同的孵育时间点：0, 2, 4, 6, 8 或 10小时。
  

5. 孵育后处理：

• 孵育结束后，将血液样本在离心机中离心，以收集上清液。
• 将上清液转移到-80°C的冰箱中保存，以备后续细胞因子的检测。
  

6. 细胞活性评估：

• 使用流式细胞术对经过PMA/ionomycin处理6小时后的免疫细胞进行活性测试。
  

7. 细胞因子检测：

• 使用相应的检测试剂盒，对上清液中的细胞因子进行多重检测。
  

8. 数据分析：

• 使用SPSS软件进行数据分析，比较不同组别之间的细胞因子水平。
  

注意事项
- 确保所有操作在无菌条件下进行，以避免污染。
- 严格按照试剂盒和设备的操作手册进行实验，以确保数据的准确性和可重复性。
- 考虑到细胞因子的半衰期较短，应在孵育后尽快进行细胞因子的检测。


实验结果
刺激剂对细胞因子产生的影响
1. PMA/ionomycin组合：

• IL-2, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, RANTES：25 ng/mL PMA和1 μg/mL ionomycin联合刺激6小时内显著增加这些细胞因子的产生。
  

2. PHA：

• IL-2, RANTES, TGF-β：在8小时后刺激可增加这些细胞因子的产生。
• IL-4, IL-6：较弱地增加这些细胞因子的水平。
  

3. PWM：

• IFN-γ, RANTES, TGF-β：1 μg/mL PWM在6小时后显著增加这些细胞因子的产生。
  

4. LPS：

• TNF-α, RANTES, IL-10：在2到6小时内显著增加这些细胞因子的产生，并对IL-2产生较弱的促进作用。
  

5. Con A：

• RANTES：显著增加RANTES的水平，但对其他细胞因子的影响较小。
  

统计图表


结果解释
- PMA/ionomycin：作为最优的刺激剂组合，因其能在较短的时间内以较低的剂量显著增加多种细胞因子的产生。
- PHA和PWM：虽然也能增加特定细胞因子的产生，但效果不如PMA/ionomycin组合显著或需要更长的孵育时间。
- LPS：主要增加了炎症相关的细胞因子，如TNF-α和IL-10。
- Con A：对细胞因子产生的影响有限，主要增加了RANTES。


参考文献：Ai W, Li H, Song N, Li L, Chen H. Optimal method to stimulate cytokine production and its use in immunotoxicity assessment. Int J Environ Res Public Health. 2013;10(9):3834-3842. Published 2013 Aug 27. doi:10.3390/ijerph10093834