流式分选GFP阳性组不成功

周熙正

求助各位老师，测定含GFP慢病毒液的滴度时，用慢病毒液感染HEK-293t，在荧光显微镜下可以观察到荧光，12h时比例在30%，但是流式结果阳性率在0.8%。是哪里出问题了吗

wxd

转染细胞相对于未转染细胞，可能更不耐受消化、离心等处理步骤。所以会导致流式检测结果低于荧光显微镜检测结果。
因为荧光显微镜激发光的原因，不合理的参数设置很容易导致观察结果偏高。建议：以未转染细胞或转染空载质粒细胞没有荧光的最大拍摄参数，或者转染细胞不过曝的参数，来拍摄转染细胞的荧光成像图片。

niwanmao

首先，激光器功率不同，结果会有不同。
其次，流式的结果设门是否根据未转染组或转染空载质粒的细胞进行对照？

Smile14

镜下看还是偏主观了一点，之前我的师弟告我有40%，让我给他做分选，跑出来比例也才10%，你可能是某几个视野荧光多一点

AndyCheung

不同的荧光镜光强是不同的，和流式可能偏差很大的

周熙正

AndyCheung 发表于 2024-5-22 19:43
不同的荧光镜光强是不同的，和流式可能偏差很大的

感谢老师

周熙正

wxd 发表于 2024-5-20 15:25
转染细胞相对于未转染细胞，可能更不耐受消化、离心等处理步骤。所以会导致流式检测结果低于荧光显微镜检测 ...

感谢您的悉心解答

周熙正

niwanmao 发表于 2024-5-19 14:14
首先，激光器功率不同，结果会有不同。
其次，流式的结果设门是否根据未转染组或转染空载质粒的细胞进行对 ...

明白了您的解答，非常感谢

周熙正

niwanmao 发表于 2024-5-19 14:14
首先，激光器功率不同，结果会有不同。
其次，流式的结果设门是否根据未转染组或转染空载质粒的细胞进行对 ...

设置了未转染和空载，空载荧光也是这种情况