PBMC Th17的IL17不表达怎么办

lpp20230609

买的工具细胞PBMC，复苏后状态挺好的（活率90%以上），悬浮培养2天后，刺激用BD的BD Pharmingen™ Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™，刺激4-5h，破膜是BD  Fixation/Permeabilization Kit， 染色IL17A-APC，从CD3+CD8-或者CD3+CD4选IL17，可是做了几次都没结果，阳性几乎为0.


求大神指导啊，头炸了要

niwanmao

3+4+的比例如何？

一般功能指标，还是最好是新鲜全血或者刚提出来的PBMC更好一些，冻存复苏后的样本有文献这么做，但难度会偏大一点

lpp20230609

Cd3CD4还可以，能达到70%左右，我也想过冻存pbmc会影响效果，但我们做检测放行的，用全血不是很现实，提取pbmc公司又成本不接受。老师能把您提到的文献分享一下嘛？拜读一下

司徒随风

lpp20230609 发表于 2024-6-5 09:04
Cd3CD4还可以，能达到70%左右，我也想过冻存pbmc会影响效果，但我们做检测放行的，用全血不是很现实，提取p ...

如果自己方便采血的话，提PBMC的成本应该不高吧，商品分离液每Test大概5块，离心管5毛（普通离心管即可）。

niwanmao

lpp20230609 发表于 2024-6-5 09:04
Cd3CD4还可以，能达到70%左右，我也想过冻存pbmc会影响效果，但我们做检测放行的，用全血不是很现实，提取p ...

我们站内OMIP收录的Protocol里面，不少是针对PBMC的：https://www.flowcyto.cn/bbs/foru ... tid=6&fromop=my

lifeng0711

用WB做一下看看是否表达了IL-17A（增大上样量哈，50ug），不表达的话就是刺激或者转运抑制没成（增加刺激时间或者浓度）。如果表达了，换个克隆号的抗体或者破膜固定液再试试。