CCR2没有表达？

瓜瓜999

测的心脏免疫细胞，文献中提到心脏有炎症后会有很多CCR2+ monocytes。
我发现虽然实验组中Ly6chi monocytes很多，但是CCR2+细胞群几乎没有。和文献不一致
另外一个课题里我也取了小鼠皮下肿瘤做流式，同样Ly6chi monocytes很多，CCR2+细胞群几乎没有。
现在不知道是操作有问题，还是本身确实就没有，不知道该从什么方向分析。

niwanmao

首先，确认模型是否可靠；
其次，确认抗体性能是否可靠，小鼠骨髓中单核细胞可能相对比较好染一点，试试看，如果仍染不出，可联系厂家技术支持确认是否换克隆号或换荧光素

瓜瓜999

niwanmao 发表于 2024-6-10 14:03
首先，确认模型是否可靠；
其次，确认抗体性能是否可靠，小鼠骨髓中单核细胞可能相对比较好染一点，试试看 ...

谢谢老师建议。
组里其他人也是相同模型，但是mouse strain不一样，有CCR2+细胞，但数量不太多。

麦小光

我建议先在CD45或者CD11b里面圈门，再看CCR2，如果这样都没有CCR2阳性群体，那就大概率你的染色或者抗体出了问题，如果只是LY6C高表达的没有，则有可能是单核细胞和CCR2表达时间不同导致的

Fusca

CCR2染不出来很多情况下都是因为抗体不行和强度不够。小鼠的CCR2抗体最推荐用R&D的，但是要注意效期，此外根据组织类型去做抗体滴定也很重要，R&D的抗体过期了确实也会染不出。其次可以选择BD或eBioscience的。推荐的克隆号可以看文献。另外就是CCR2表达还是比较弱的，推荐用PE和APC。千万不要用B家的，用CCR2 ko小鼠试过了，不该表达的有很强的非特异性表达该表达的细胞倒是啥也染不上

瓜瓜999

Fusca 发表于 2024-6-11 11:58
CCR2染不出来很多情况下都是因为抗体不行和强度不够。小鼠的CCR2抗体最推荐用R&D的，但是要注意效期，此外 ...

非常感谢。请问你说的B家是指biolegend吗，我们用的就是biolegend的＞︿＜，没有用APC PE，选的BV

瓜瓜999

麦小光 发表于 2024-6-10 22:49
我建议先在CD45或者CD11b里面圈门，再看CCR2，如果这样都没有CCR2阳性群体，那就大概率你的染色或者抗体出 ...

CD45和CD11b里都没有(T_T)
有篇文章(bioRxiv)，用的相同模型，他们做的single-cell seq，发现有 Ccr2+/Ly6c+ monocyte cluster。
我染的其他marker都还算可以，但是CCR2一点也没有，所以我在想是不是抗体的问题

Fusca

瓜瓜999 发表于 2024-6-11 16:24
非常感谢。请问你说的B家是指biolegend吗，我们用的就是biolegend的＞︿＜，没有用APC PE，选的BV ...

对的，因为我们要分选CCR2+/-单核，专门测试过各家的抗体，这家的真的染不出来单核，我推荐的那几个起码我们做血和骨髓是可以染到正确的群。另外BV的话你用的这个V810太弱了，如果一定要用用V/UV的话可以考虑BV421/BUV395，不局限的话更推荐PE/APC。CCR2的表达不是很强，想要好看的分群一定要强荧光素+滴定。

一个测试CCR2抗体比较好的方法是取小鼠的血作为阳性对照，染CD11b、Ly6C、Ly6G和CCR2, CD11b+Ly6G-Ly6C+的细胞里有30%-50%是CCR2阳性的，且分群较好。可以利用这个已知的数据去看这个抗体是不是真的坏了。

麦小光

Fusca 发表于 2024-6-11 21:11
对的，因为我们要分选CCR2+/-单核，专门测试过各家的抗体，这家的真的染不出来单核，我推荐的那几个起码我 ...

对的，中低表达的蛋白，配合低效价的抗体，再整上低亮度的荧光素，基本上就是一个大写的GG

麦小光

瓜瓜999 发表于 2024-6-11 16:46
CD45和CD11b里都没有(T_T)
有篇文章(bioRxiv)，用的相同模型，他们做的single-cell seq，发现有 Ccr2+/Ly ...

对的，中低表达的蛋白，配合低效价的抗体，再整上低亮度的荧光素，基本上就是一个大写的GG，流式配色不能瞎配，强蛋白配合中低荧光，弱蛋白配合强荧光，这样才会高效又经济。Biolegend的东西得去试，属于高性价比的东西，虽然是进口牌子，但是质控不怎么严格，反而我最近试了一些国产的都比他家强，什么联科，四正柏之类的。
可以参考之前倪老师的帖子：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7895-1-1.html
还有就是流式荧光素强弱排名：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.ph ... amp;_dsign=03b1fcf1
Mair F, Tyznik AJ. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.