利用内源性荧光通过流式细胞术分析细胞代谢

niwanmao

了解不同细胞类型的代谢状态对于阐明其生物学功能至关重要，特别是在健康和疾病的背景下。细胞代谢的典型特征是使用细胞外通量分析测量参数，如耗氧量率 (OCR) 和细胞外酸化率 (ECAR)。然而，这种方法需要大量的细胞，不容易解决异质性细胞群内的代谢差异。

为了解决这一限制，Abir AH等人建立了一种基于流式细胞术的方法，利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 等代谢辅因子的内源性荧光。通过定量 FAD 与 NADH 荧光的比率（即光学氧化还原比率 (ORR)），研究人员可以动态监测复杂样本内不同细胞类型的代谢状态变化。这种无标记技术允许对细胞代谢进行高通量、单细胞分析。

材料和方法
细胞样本：
- 从脾细胞中分离原代小鼠 B 细胞，与脂多糖 (LPS) 共同培养3d，使其活化。
- 使用转基因小鼠 B 细胞系，包括葡萄糖转运蛋白 Glut1(Glut1KO) 缺失或表达线粒体解旋酶 Twinkle(DNT) 显性负性版本的细胞系。
- 从健康供体 (HD) 和类风湿性关节炎 (RA) 患者中分离人外周血单核细胞 (PBMC)。

流式细胞术：
- 用靶向表面标记物的荧光标记抗体对细胞进行染色，以鉴定不同的细胞群。
- 用 355 nm UV 激光激发细胞，分别在 450 nm 和 560 nm 处检测发射，测定 NADH 和 FAD 荧光。
- 计算光学氧化还原比 (ORR) =FAD/(FAD + NADH)，以定量这些代谢辅因子氧化成还原形式的相对丰度。
- 在流式细胞术过程中依次用代谢调节剂（葡萄糖、寡霉素、FCCP等）处理细胞，评估动态反应。


细胞外高通量分析：
- 使用 Seahorse 糖酵解应激试验和 Mito 应激试验分析 Jurkat T 细胞和原代小鼠 B 细胞，分别测量 ECAR 和OCR。
- 比较流式细胞术和细胞外高通量分析的结果，以验证作为细胞代谢指标的ORR。

结果
1、验证ORR作为代谢指标的有效性
作者首先证明了 ORR 在使用 Jurkat T 细胞系捕获动态代谢变化中的实用性。用葡萄糖处理 Jurkat 细胞可增加 NADH 荧光，降低ORR，反映糖酵解增强。相反，耗尽NAD+储备的 NAMPT 抑制剂 FK866 提高了ORR。

对比基于流式细胞术的ORR测量值与细胞外高通量分析时，作者发现 ORR 与 OCR 强相关，但与 ECAR 无强相关。这表明 ORR 提供了与 ECAR 互补的信息。


2、原代小鼠 B 细胞的代谢特征
研究人员将该流式细胞术方法应用于原代小鼠 B 细胞，利用基因修饰细胞系来基准ORR。
- 与静息细胞相比，LPS激活的野生型 B 细胞表现出更高的 NADH 荧光，与以前的报道一致。
- 缺乏葡萄糖转运蛋白 Glut1(Glut1KO) 或表达显性负相 Twinkle(DNT) 的 B 细胞显示较低的 NADH 荧光和较高的ORR，分别表明糖酵解和氧化磷酸化受损。
- 与野生型相比，添加葡萄糖导致 DNT B 细胞 NADH 和 FAD 荧光增加更多，表明糖酵解能力增强。
- 寡霉素是一种 ATP 合成酶抑制剂，可增加野生型 NADH 荧光，但不增加 Glut1KO 或 DNT B 细胞 NADH 荧光，反映了其呼吸缺陷。

这些结果表明，ORR可以忠实地报告原代小鼠 B 细胞中糖酵解和氧化磷酸化的遗传扰动诱导的代谢改变。

3、B细胞群内的代谢异质性
当分析 LPS 激活的小鼠 B 细胞培养物时，作者观察到通过表面标记物表达鉴定的不同亚群之间的代谢差异：
- 与活化程度较低 (GL7low) 的B细胞相比，生发中心B细胞 (GL7high) 表现出较高的基础 NADH 和 FAD 荧光。
- 浆母细胞 (TACI+ CD138+) 显示 GL7high 和 GL7low 细胞之间的中间代谢表型。
- 尽管营养利用存在这些差异，但 ORR 在B细胞亚群中保持相对恒定，表明氧化还原平衡受到严格调控。


这些发现强调了基于流式细胞术的 ORR 方法揭示复杂细胞群内代谢异质性的效力，这在质谱分析中可能被掩盖。

4、类风湿性关节炎患者 B 细胞和 T 细胞的代谢改变
最后，研究人员应用他们的技术分析了健康人 (HD) 和类风湿性关节炎 (RA) 患者的PBMC。主要观察结果包括：
- 与初始B细胞和T细胞相比，静息转换记忆 B 细胞表现出较低的ORR，表明糖酵解表型更多。
- 在葡萄糖刺激下，与RA患者的细胞相比，HD的初始B细胞和T细胞显示 NADH 和 FAD 荧光的增加更明显。
- FCCP处理（使氧化磷酸化解偶联）后， HD 的转换记忆 B 细胞、非转换记忆 B 细胞和 T 细胞中，NADH和FAD荧光的下降，比RA患者更明显。

这些结果表明，与健康对照组相比，RA患者的淋巴细胞表现出葡萄糖反应代谢途径减弱。具体来说，RA淋巴细胞在将葡萄糖代谢偶联到线粒体呼吸上的效率似乎较低。


可见，这项研究证明了基于流式细胞术的ORR定量作为在单细胞水平探索细胞代谢的有力工具的实用性。通过利用 NADH 和 FAD 的内源性荧光，能够动态监测响应各种扰动的代谢变化，而不需要外源性标记。这种方法的一个关键优势是能够分析复杂细胞群内的代谢异质性，例如 B 细胞亚群的不同代谢特征。这种分辨率水平对于传统的体积测量（如细胞外高通量分析）具有挑战性。


参考文献：Abir AH, Weckwerth L, Wilhelm A, et al. Metabolic profiling of single cells by exploiting NADH and FAD fluorescence via flow cytometry. Mol Metab. Published online July 4, 2024. doi:10.1016/j.molmet.2024.101981

facetodog

正所谓老菜新做