C57小鼠外周血流式细胞问题请教

cenzhikang

大佬们好，第1次做流式，想请教一下各位大佬，我的目标是检测小鼠外周血的中性粒细胞，现在我的步骤是小鼠眼球取血至EDTA抗凝管中，用枪头吸100uL分装至另一个EDTA抗凝管中，加入500ul红细胞裂解液吹打（碧云天C3702），冰上裂解10min，加入1ml PBS终止，4度 500 x g离心5min，弃上清，加入200uL PBS重悬后，上机检测，鞘液使用超纯水代替，目前做的结果是这样，有一些问题想请教：
1. 请问这样算裂解成功了吗，不知道我划的分群是否正确
2. 如何通过肉眼判断红细胞裂解时间
3. 目前只是熟悉流程，还没有买抗体，我看文献中有一些需要先使用CD45，再使用Ly6G，能否直接通过物理特性分出粒细胞，再通过Ly6G确定中性粒细胞
4. 如果我想在中性粒细胞的基础上再染Ly6G，CD11b双阳性，那我最终是不是需要将外周血分出四管，分别染双抗体，单抗体*2和一管不加一抗，如果需要四管，血液不太够，可以将样本减少至50uL吗
5. 正式实验中，因为我需要进行小鼠取材，大概10min左右完成一只小鼠的取材工作，无法第一时间取血做流式，请问外周血放在抗凝管中可以保存多久再做流式，所有小鼠取材大概需要2h
第一次接触流式细胞，感谢各位大佬前辈给予指导

Fish形影单只

1、我个人觉得你的ssc太高了。你圈的单核应该是淋巴细胞、你圈的粒细胞应该是单核。
2、你可以做一个对比，先拿一只标本加溶血素十分钟，然后再来一只标本加入溶血素。对比起来看刚刚加入溶血素液体是浑浊的，已经溶血十分钟的是透明的。还有就是离心以后应该是没有红细胞的。
3、你最好还是老老实实的买CD45，免得答辩或者审稿人给你提意见你没办法解释。而且加了45你能更好的确定你的第一个问题。
4、你只需要预实验的样本跑4管，把电压和补偿调节好就行。其他样本不需要这么麻烦。抗体颜色别买错啊，找靠谱的试剂商。新人最大的坑就是颜色买成一样的。
5、外周血，取了以后抗凝管上下颠倒10-20次，和抗凝剂充分混合，室温两三天都没问题。我建议你买EP管包被的抗凝管，医院的抗凝管太大了，反而容易凝血。

cenzhikang

Fish形影单只 发表于 2024-7-11 14:35
1、我个人觉得你的ssc太高了。你圈的单核应该是淋巴细胞、你圈的粒细胞应该是单核。
2、你可以做一个对比， ...

感谢大佬的解答，请问如何我要检测CD45 CD11b Ly6G，那就需要这三个抗体的颜色区分开，然后同时染一次调节补偿吗

Fish形影单只

cenzhikang 发表于 2024-7-11 17:23
感谢大佬的解答，请问如何我要检测CD45 CD11b Ly6G，那就需要这三个抗体的颜色区分开，然后同时染一次调 ...

是的，只需要第一次单独跑，记录好电压和补偿，后面直接调用就行。

cenzhikang

Fish形影单只 发表于 2024-7-12 09:45
是的，只需要第一次单独跑，记录好电压和补偿，后面直接调用就行。

请问这样的protocol大概流程是对的吗，还有没有需要特别注意的地方，感谢大佬
1. 眼球取血至EDTA抗凝管中，抗凝管上下颠倒10-20次（室温可保存2-3天），用移液枪将100ul抗凝血分装至另一个EDTA抗凝管中，加入一抗，37°C避光孵育30min
2. 加入500ul红细胞裂解液（碧云天C3702），轻轻吹打混匀，室温裂解10min（裂解过程中偶尔摇动）
3. 4℃ 500g离心5分钟，弃红色上清
4. 如果发现红细胞裂解不完全，重复2和3一次
5. 洗涤1-2次：加入适量PBS，重悬沉淀，500g离心2-3分钟，弃上清，最后用PBS重悬后置于冰上
6. 上机检测，提前开机，开机流程需要10min左右
然后，裂红后是否需要加入固定液，问题有点多，感谢大佬的解答

Fish形影单只

cenzhikang 发表于 2024-7-12 11:07
请问这样的protocol大概流程是对的吗，还有没有需要特别注意的地方，感谢大佬
1. 眼球取血至EDTA抗凝管中 ...

1、取50-100ul抗凝血到流式管中，加入荧光抗体。室温避光30min。（染色、溶血、洗涤全在流式管中进行）
2、可以多加一点。我一般加2ml，溶血速度快。我用的BD的临床溶血素（349202），有固定作用。
4、最好一次溶血完成，溶血次数和时间太长，细胞都得碎了。
5、加2mlPBS洗一次就行，离心去上清加500ulPBS就可以上机了。没必要放冰上。
当天能检测完就不需要固定。

cenzhikang

Fish形影单只 发表于 2024-7-12 15:07
1、取50-100ul抗凝血到流式管中，加入荧光抗体。室温避光30min。（染色、溶血、洗涤全在流式管中进行）
2 ...

您好，我已经将信息给了抗体公司，他们推荐了抗体及同型对照，还有死活染料，因为加在一起预算比较高，请问死活染料可以不用吗，推荐的所有抗体都是BD的

Fish形影单只

cenzhikang 发表于 2024-7-18 15:35
您好，我已经将信息给了抗体公司，他们推荐了抗体及同型对照，还有死活染料，因为加在一起预算比较高，请 ...

外周血我都没有用死活，只有组织样本我才加死活。具体加不加还是得看你自己。

cenzhikang

Fish形影单只 发表于 2024-7-18 15:49
外周血我都没有用死活，只有组织样本我才加死活。具体加不加还是得看你自己。 ...

谢谢，那请问推荐的BD抗体咋样，我看文献里ebioscience和biolegend用的比较多

CPUSnape

cenzhikang 发表于 2024-7-18 16:00
谢谢，那请问推荐的BD抗体咋样，我看文献里ebioscience和biolegend用的比较多

bd很好，就是相对来说贵一点