请教THP1诱导M1/M2的流式鉴定方案

asuka

我们想检测某个药物对巨噬细胞极化的影响，没做过巨噬细胞，想先明确M1/M2流式表型。
我们做了初步尝试，THP1细胞PMA诱导后几乎全贴壁，应该是M0了，接下来准备LPS+IFNγ诱导M1，IL4+IL13诱导M2，分别作为M1和M2的对照，但是调研中有些困惑想请教各位老师：

基本上简单方案都是先圈出巨噬细胞之后，再根据CD80和CD206，分出CD80+CD206-的M1和CD80+CD206+的M2
1 我拿不准的是，针对THP1诱导的巨噬细胞，更合适的marker是CD11b/c还是CD68还是CD14呢，看的文献里CD14好像不是很合适（极化后又会下调），CD68要不要破膜有各种说法，我倾向于选择CD11c，因为实验室有抗体不需要新购，也查到文献CD11b和CD11c都是在THP1不表达，在PMA诱导后表达（虽然不太高），但是不知为何感觉文献里用CD68的多
2 看到有老师提到CD206流式不好做，又有破膜不破膜的各种说法，请问有比较成熟的protocol吗？
3 对于CD80，也有文献里M2是CD80-的？（看到的是M0 CD80-, M1 CD80+, M2 CD80-），为什么那个方案里M2是CD80+CD206+呢……
4 THP1和人外周血诱导的巨噬细胞，在流式表型方面，有没有需要注意的差别呢，后续我可以直接用这个方案搬到外周血诱导培养的巨噬上吗

niwanmao

我看过的文献，基本上都是用不同的诱导剂诱导之后，直接测CD68、CD80、CD206等标记，通过强度的改变，去直接判断究竟往哪个方向分化，而不是像淋巴细胞亚群那样存在极其分开的不同群体。

asuka

niwanmao 发表于 2024-7-16 14:49
我看过的文献，基本上都是用不同的诱导剂诱导之后，直接测CD68、CD80、CD206等标记，通过强度的改变，去直 ...

谢谢老师，你的意思是说M1和M2不是明确分开的细胞群吧，那么基本上还是圈了CD68+之后看CD80/CD206的变化？不纠结于它应该是+还是-？
这种场景下为什么都选择CD68先圈巨噬细胞呢？CD11c可以替代吗？

CPUSnape

我认为，那个巨噬细胞的圈门方案是没有必要的，你加完PMA全贴壁了，那就都是巨噬细胞了，不用管了。另外无论是CD11b/c还是CD68还是CD14其实都是没有办法表征这是巨噬细胞的，没有必要加上这个指标。
CD206确实有破膜和不破膜的方案，我的推荐是购买BD的新的CD206-pe的抗体，这个抗原表位在细胞表面，是可以不破膜的，缺点就是贵一点，然后现在只有pe通道，表位结合相对来说不如原来的破膜方案，所以配的颜色也是比较亮的pe
我看过的文献基本都是M1 80 86；M2 206
外周血的那个不是完全可以照搬的，首先你要分离单核细胞，然后通过在血清内贴壁培养诱导出来巨噬细胞，具体可以参考一下这个文献b-Glucan Reverses the Epigenetic State of LPS-Induced Immunological Tolerance

niwanmao

asuka 发表于 2024-7-16 15:45
谢谢老师，你的意思是说M1和M2不是明确分开的细胞群吧，那么基本上还是圈了CD68+之后看CD80/CD206的变化 ...

没有用68设门，是全部圈起来

asuka

niwanmao 发表于 2024-7-16 16:29
没有用68设门，是全部圈起来

这样啊，那他们测CD68的表达变化，意义是什么呢？

asuka

CPUSnape 发表于 2024-7-16 16:14
我认为，那个巨噬细胞的圈门方案是没有必要的，你加完PMA全贴壁了，那就都是巨噬细胞了，不用管了。另外无 ...

谢谢。贴壁的可以被认为都是巨噬细胞吗？我们已经买了biolegend的CD206-APC……看了网站上是FC不是ICFC，先不破膜试试看吧

niwanmao

asuka 发表于 2024-7-17 21:10
这样啊，那他们测CD68的表达变化，意义是什么呢？

重点不是讲CD68，前面提CD68只是顺着你的意思，指的是文章中会把所有的巨噬细胞分型、功能等相关分子放进去做。

并且，文章中把所有的活细胞圈起来，分析其各表面分子或胞内分子的表达水平改变，从而了解其往哪个方向分化。


详请参见之前的一篇帖子，里面有图：一个新方案，区分小鼠M0、M1、M2a、M2c巨噬细胞亚型
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-10933-1-1.html
(出处: 流式中文网)