磁性流式细胞术做CD4+T细胞的POCT，无需光学组件

niwanmao

CD4+ T淋巴细胞计数是评估免疫功能的关键生物标志物，尤其是在监测 HIV 感染进展和治疗疗效方面。目前CD4+ T细胞定量的金标准方法依赖于光学流式细胞术，这需要复杂的样本制备、昂贵的设备和专门的实验室设置。这些限制阻碍了CD4+ T细胞检测的广泛获得，特别是在资源有限的地区，HIV流行率往往最高。

Leuthner M等人开发一种使用磁性流式细胞术 (MFC) 进行CD4+ T细胞计数的床旁 (POC) 替代方法。这种新方法利用免疫磁性细胞标记和磁电阻传感器来检测和定量靶细胞，无需光学组件，可从全血样本中进行准确的CD4+ T细胞计数，操作步骤少，可能使HIV 患者管理的快速现场检测成为可能。

方法
磁性流式细胞仪设计
MFC 系统的核心由一个硅芯片组成，集成了巨型磁阻 (GMR) 传感器，配置为惠斯通电半桥排列。每个传感元件测量值为2 x 30 μm2。值得注意的是，芯片表面以 V 形图案排列的磁性镍铁轨道为特征，将磁化细胞精确聚焦到 GMR 传感器上。

位于传感器芯片下方的钕-铁-硼永磁体 (32 x 27 x 6 mm3) 产生 120-150 mT 的垂直磁场，以吸引磁标记细胞到传感器表面。使用软光刻制作聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微流控通道（700 μm宽，150 μm高），并定位在传感器阵列上，以促进样品流动。


信号生成和处理
Wheatstone 半桥提供 10 kHz 调制信号（0.15-0.4 V峰-峰）。使用三阶低通滤波器（300 μs时间常数）过滤差分输出，并通过锁定放大器放大10000倍。数据采集以 10 kS/s 的速度进行，分辨率为16位。

定制 LabVIEW 程序控制数据记录，并结合安装在显微镜上的高分辨率 CMOS 相机的光学相关性进行目视验证。信号分析采用状态事件机器算法来检测标记细胞通过 GMR 传感器时产生的特征四峰信号。

样本制备和细胞标记
用含 EDTA 的试管采集健康供体的新鲜静脉血。对于CD4 + T细胞的免疫磁性标记，研究人员使用了由葡聚糖包被的磁性纳米颗粒 (MNPs) 和CD4抗体组成的商业试剂盒 (EasySep Human CD4 Positive Selection kit II，STEMCELL Technologies)。

将全血与抗体和 MNP 试剂以8:1:1的比例（例如，40 μL血液 + 5 μL抗体 + 5 μL MNPs）在旋转振荡器中孵育30 min，以防止细胞沉降。

实验条件
为了研究细胞背景对 MFC 性能的影响，研究人员进行了以下实验：
1. 稀释的样本：使用磁性分离器提取磁性标记的CD4+ T细胞，并以不同浓度重悬于全血中。然后在 MFC 分析前，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 以1:10或1:50稀释这些样品。
2. 模拟患者样本：为了模拟在 HIV 患者中观察到的CD4 + T细胞浓度范围，在磁标记前用自体血浆稀释全血。该方法产生了具有10-100%全血组分和相应CD4 + T细胞浓度的样本。

MFC检测
使用 MFC 系统分析制备的样本，流速为25-30 μL/min。每份样本的测量时间通常为3 min。系统记录细胞速度、推断的磁直径和每个检测到的细胞事件的信号振幅。

对比光学流式检测
使用 MACSQuant 分析仪 10(Miltenyi Biotec) 作为CD4 + T细胞定量的参考方法。全血样品 (20 μL) 用抗CD4、CD3和 CD45 的荧光微球偶联抗体染色。孵育 30 min 后，用缓冲液以1:30稀释样品，并立即进行分析。

结果

细胞背景对 MFC 性能的影响
研究人员首先研究了其他血细胞（主要是红细胞）的存在如何影响 MFC 检测和定量CD4 + T细胞的能力。

1、信号质量：磁性标记的CD4+ T细胞产生的特征性四峰信号在全血的1:10和1:50稀释液中均保持明显且可检测到。这证明了该方法在细胞背景存在下的耐用性。


2、浓度检测：对于1:10和1:50血液稀释液，MFC测定的CD4+ T细胞浓度在61-1212个细胞/μL范围内表现出强线性 (R2≥0.99)。然而，与 OFC 参考测量值相比，MFC检测到的细胞数量始终偏低：
- 1:50稀释度：计数减少约10%
- 1:10稀释度：计数减少约24%

3、红细胞压积效应：患者红细胞压积的生理变化 (37-52%) ，会导致MFC检测CD4 + T细胞浓度时约1.4%的误差。

4、细胞特征：细胞滚动速度分析和推断的磁直径显示：
- 平均速度：687 μm/s（变异系数 [CV] = 0.34）
- 平均磁直径：6.9 μm(CV = 0.41)
- 在最高细胞浓度（1212个细胞/μL）下观察到两个参数轻微增加，可能是由于细胞聚集。

模拟 HIV 患者样本
为了评估在 HIV 患者中观察到的临床相关CD4 + T细胞浓度范围内的 MFC 性能，研究人员在磁标记前用自体血浆稀释全血创建了模拟样本。主要结果包括：

1、线性：在109-898个细胞/μL浓度范围内，MFC测定显示线性良好 (R2 = 0.98)。

2、精密度：变异系数从最低浓度（10%全血）的0.20改善至较高浓度（75%全血）的0.04。然而，未稀释全血中的变异性增加 (CV = 0.24)，表明在这种情况下磁性流式POCT仍存在挑战。

3、准确度：在全血比例为100%时，MFC测量值比 OFC 参考值低约29%。

4、细胞特征与全血比例：
- 细胞速度和磁直径在较低的全血比例中增加，可能是由于细胞聚集体的形成。
- 在较低的全血比例中，信号振幅也增加，表明每个细胞的磁性纳米颗粒负荷较高或存在磁性颗粒聚集体。

表：MFC性能特征总结


总之，这项研究证明了磁性流式细胞术作为CD4 + T细胞计数POCT方法的潜力。尽管与光学流式细胞术参考测量值存在一些差异，尤其是在未稀释的血液中，但在资源有限的环境中，MFC可提供一种更简单、更容易获得的免疫状态监测方法。进一步优化磁性标记方案和开发内部校准标准品可以提高这种有前景的技术的准确性和可靠性。


参考文献：Leuthner M, Reisbeck M, Helou M, Hayden O. Towards a Point-of-Care Test of CD4+ T Lymphocyte Concentrations for Immune Status Monitoring with Magnetic Flow Cytometry. Micromachines (Basel). 2024;15(4):520. Published 2024 Apr 13. doi:10.3390/mi15040520IF: 3.4 Q2