小鼠全血样本流式

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各位大佬们好，最近在做小鼠的全血样本流式，现有问题想请教一下大佬，想检测一下NOG鼠TB敲除的干不干净，我分别取了C57小鼠和NOG小鼠各100uL眼球血，裂红后染色流式，染了CD45 CD3 CD19，补偿用Beads调的，流式图很奇怪，有几个问题请各位大佬答疑解惑一下。

1.根据C57全血样本流式图，最下面的是淋巴细胞，稍微大一点的是单核细胞，然后第一张图只圈淋巴细胞，T和B位置和占比都挺正常的，但是CD3-CD19-的阴性群有点斜
2.第二张图我把淋巴细胞和单核细胞都圈上，就发现CD3-CD19-的这群双阴性细胞变多，而且都是斜对角线上的。而且反圈门回去看FSC SSC， 这群细胞就是单核细胞，为什么会这样？
3.我又做了NOG的鼠，然后按照C57的位置圈了细胞，CD3 CD19的流式图就更奇怪了？为什么会出现这种情况？
PS：是我圈门有问题吗？鼠样本我没做FC block，是这个原因吗？染色抗体量是100ul-0.1ug鼠抗体，是我抗体用量的原因吗？我用补偿Beads染的抗体然后调的补偿，是补偿调整的不太对？
第一次碰见这种情况，已经开始怀疑自己对淋巴细胞的判断了，谢谢各位大佬指导

小鼠全血样本

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求各位大佬答疑解惑

CPUSnape

阴性群有点斜，你可以试试微调一下补偿看看，或者重新做你的单染。就不用微球了，拿样品试试。
你的前面圈门逻辑里面，CD45用到了吗，用到了画出来看看。
你试试封闭吧，克隆号不同也说不定会影响，下次可以试试。

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CPUSnape 发表于 2024-7-22 09:58
阴性群有点斜，你可以试试微调一下补偿看看，或者重新做你的单染。就不用微球了，拿样品试试。
你的前面圈 ...

CD45染的正常的，后面圈CD3 CD19就是gate了CD45后圈的。如果我淋巴细胞和单核细胞位置圈的对的话，这个单核细胞的图真的很奇怪。这个图奇怪是因为补偿调的不合适吗？我下次用鼠的淋巴细胞染一下单染试试。这次实验block没到就没染，下次我加上。太奇怪了这个图，找不到原因是啥