请问我圈的这个门是小鼠外周血中性粒细胞嘛

cenzhikang

各位大佬好，我想检测小鼠外周血中性粒细胞表面marker，现在还没买流式抗体，先使用间标流式熟悉了一下流程，目前操作如下，小鼠眼球取血至EDTA包被的1.5mlEP管，用移液枪取100ul至另一个管中，加入Ly6G抗体4度孵育30min，PBS重悬洗三次（400g 5min），加入488荧光二抗避光4度孵育30min，PBS重悬洗三次（400g 5min），加入1ml红细胞裂解液，4度裂解10min，400g 5min，加入200ul PBS重悬上机检测
这次结果如下，请问我圈的细胞是中性粒细胞嘛，488还有一些弱阳性是因为抗体的原因吗

CPUSnape

是中性粒细胞，但是建议用直标一抗，别用1+2抗了，FC阻断一下或者做一下isotype control确定一下阴性群位置。一般来说小鼠外周血的Ly6g能分的特别开。

niwanmao

是中性粒

至于阴性区域非特异性偏强，考虑试一下Fc阻断看看

cenzhikang

niwanmao 发表于 2024-7-23 21:13
是中性粒

至于阴性区域非特异性偏强，考虑试一下Fc阻断看看

谢谢老师

cenzhikang

CPUSnape 发表于 2024-7-24 10:27
是中性粒细胞，但是建议用直标一抗，别用1+2抗了，FC阻断一下或者做一下isotype control确定一下阴性群位置 ...

嗯嗯，因为买的抗体货期比较久，又怕买回来做错了，我就找实验室已有的抗体练习了一下操作，谢谢大佬

zzzlll.

niwanmao 发表于 2024-7-23 21:13
是中性粒

至于阴性区域非特异性偏强，考虑试一下Fc阻断看看

您好，我想请问我也有类似的非特异性变强的现象，不过我是抗体染带相应抗原的微球，不知道是否也是Fc段需要封闭的原因呢？Fc会和微球结合或者吸附吗

niwanmao

zzzlll. 发表于 2024-7-25 08:53
您好，我想请问我也有类似的非特异性变强的现象，不过我是抗体染带相应抗原的微球，不知道是否也是Fc段需 ...

微球主要是由于是实心的，所以自发荧光增强是主要因素；其次抗原的非特异性结合会有，但应该主要不是Fc段。

所以，Fc阻断没法降低。

zzzlll.

niwanmao 发表于 2024-7-25 09:02
微球主要是由于是实心的，所以自发荧光增强是主要因素；其次抗原的非特异性结合会有，但应该主要不是Fc段 ...

好的 谢谢

落叶风吹

zzzlll. 发表于 2024-7-25 08:53
您好，我想请问我也有类似的非特异性变强的现象，不过我是抗体染带相应抗原的微球，不知道是否也是Fc段需 ...

如果是接好抗原的微球一般出厂前都会进行封闭，非特异性理论上很比较低的。不过有时候封闭剂用的比较差也会导致很高的非特异性结果

zzzlll.

落叶风吹 发表于 2024-7-26 09:09
如果是接好抗原的微球一般出厂前都会进行封闭，非特异性理论上很比较低的。不过有时候封闭剂用的比较差也 ...

现在也不知道是啥原因了，都一一排除过了