中性粒细胞固定破膜

Eniac

请问中性粒细胞固定破膜后细胞形态会有很大变化吗？下图左图为固定破膜前，右图为固定破膜后，因为没有染死活，不知固定破膜后应该圈哪一群细胞。求助各位大佬。
实验方法：人外周血用淋巴细胞分离液（Ficoll）进行密度梯度离心，取中性粒细胞层，裂解红细胞后，进行流式染色，因此下图中的细胞基本为纯净的中性粒细胞。固定破膜使用的是biolegend Cyto-Fast Fix/Perm Buffer。

h1030506

从图上看，3群还是蛮清晰的。因为一般固定破膜后细胞群会被压缩在左下角，所以我个人认为1群为目的细胞群，2群为目的细胞群的粘连体，3群暂不明确，判定死活还是需要增加染料的。不过粒细胞样本特别容易产生非特异性染色，建议下次实验前除了死活染料，还可以做一下Fc Blocking，这样细胞群之间会干净一些。

niwanmao

是会发生较大改变的，跟固定、破膜成份有关

Eniac

谢谢老师的回复！我使用的是biolegend的Cyto-Fast Fix/Perm Buffer，成分未注明，我想应该包含皂苷，但浓度未知。请问这种细胞形态较大改变的，哪一群细胞是可以圈出来进行后续分析的细胞群？

niwanmao

Eniac 发表于 2024-7-25 21:21
谢谢老师的回复！我使用的是biolegend的Cyto-Fast Fix/Perm Buffer，成分未注明，我想应该包含皂苷，但浓度 ...

还是得用系列特异性标记来确定是哪一群，光凭FSC和SSC是很难定的

Eniac

谢谢老师的回复。附图中为我进行了中性粒细胞特异性染色的结果，圈门逻辑为前侧向→去粘连→CD45+→CD66b+CD16+。第一张图为未固定破膜的中性粒，其余为固定破膜后的中性粒，我将3群细胞分别圈门进行分析，请老师看一下哪一种圈门方式是合适的。
另外，我使用的是CD66b、CD16作为中性粒细胞的Marker，请问是否能够正确标记中性粒？目前人中性粒细胞的Marker有多种，包括CD11b、CD66b、CD15、CD16等，诸多文献用的Marker也比较混杂，不知仅选用CD66b、CD16两个分子进行标记是否能够被认可。

落叶风吹

从图中看，破膜后横坐标整体左移了（我做的结果也是破膜比未破膜更靠左），右上一群混入了很多非粒细胞，右下一群应该是破膜后的粒细胞。看下圈门的细胞数量或占比

Eniac

谢谢回答！请问后续分析中性粒细胞，圈右下一群即可，还是左下一群也要圈进去？（如附图所示）但若同时圈左下一群和右下一群，粘连会比较难圈，尤其右下一群的粘连较严重，且CD45也会出现两群。
另外，这是从外周血中分离的纯粒细胞，右上一群应该不是非粒细胞，是否可能是死细胞？

CPUSnape

Eniac 发表于 2024-7-26 09:13
谢谢回答！请问后续分析中性粒细胞，圈右下一群即可，还是左下一群也要圈进去？（如附图所示）但若同时圈左 ...

那就加个死活染料呗

Eniac

谢谢回答！此次中性粒细胞染色已经加了FcR Blocking。下次我染个死活试一下。