谷胱甘肽过度产生介导淋巴瘤起始细胞的存活并以性别依赖的方式影响淋巴瘤的发生

niwanmao

尽管癌症治疗取得了进展，但淋巴肿瘤患者往往会对标准疗法产生抗性或在初次缓解后复发。肿瘤起始细胞（TICs）是肿瘤细胞的一小部分，具有再生整个肿瘤的能力，被认为是复发的原因，因为它们对治疗的抗性很高。然而，由于常规细胞表面标记物的不可靠性，识别和分离TICs一直是一个挑战。

最近的研究表明，在三维（3D）凝胶中培养细胞可以将致瘤细胞与非致瘤细胞区分开来，因为3D凝胶中的生长与致瘤性密切相关。这一发现为研究TIC特异性信号通路和识别跨多种癌症类型的共同治疗靶点提供了独特的机会。

西班牙的Alberto H.-Alcántara等人研究了为什么TICs是唯一能够在3D凝胶中生长的肿瘤细胞，而非肿瘤淋巴样细胞则不能。他们假设，了解使TIC在3D凝胶中生长的分子机制可能会揭示新的靶点，以选择性地抑制TIC的生长并防止淋巴瘤的发生。他们的研究集中在氧化应激和抗氧化系统（特别是谷胱甘肽的产生）在介导淋巴样肿瘤细胞在3D凝胶和体内存活和生长中的作用。

材料与方法
细胞培养和3D凝胶实验
研究人员使用了多种细胞类型，包括淋巴母细胞样B细胞系（LCLs）X50-7和JY、淋巴瘤B细胞DG-75和BL-2、Jurkat急性T细胞白血病细胞以及来自健康捐赠者的外周血淋巴细胞（PBLs）。细胞在标准的2D液体培养基中培养或嵌入由Matrigel或甲基纤维素组成的3D凝胶中。

流式细胞术分析
在整个研究过程中，流式细胞术被广泛用于分析各种细胞参数：
- 细胞周期和凋亡：从3D凝胶中回收细胞，用70%乙醇固定，并用碘化丙啶（PI）染色。使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）分析DNA含量。分析不同细胞周期阶段（G0/G1、S、G2/M）的细胞百分比和亚G0/G1凋亡细胞群。
- 细胞活力：采用两种方法：
a) 前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）分析以评估细胞大小和颗粒度的变化。
b) 钙黄绿素-AM染色，活细胞可将非荧光钙黄绿素-AM转化为荧光钙黄绿素。在流式细胞术分析前，将细胞与钙黄绿素-AM在37°C下孵育30分钟。
- 活性氧（ROS）检测：用2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染色细胞，DCFDA是一种细胞渗透性荧光染料，可测量细胞内羟基、过氧基和其他ROS活性。在37°C下与DCFDA孵育30分钟后，通过流式细胞术测量荧光强度。
- 细胞内谷胱甘肽测量：用单氯双咪（mBCl）染色细胞，mBCl与谷胱甘肽结合后发出荧光。在37°C下与mBCl孵育20分钟后，通过流式细胞术分析荧光强度。
- 对于所有流式细胞术实验，每个样品至少采集10,000个事件。使用FlowJo软件进行数据分析，并采用适当的门控策略以排除碎片和双重体。

遗传和药理学操作
为了研究谷胱甘肽在细胞存活和生长中的作用，研究人员采用了遗传和药理学方法：
- GCLC敲低：使用编码shRNA的慢病毒沉默谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLC）的催化亚基。测试了多个shRNA序列，并通过Western blot和RT-qPCR验证敲低效率。
- 药理学抑制：
a) 使用DL-丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO）抑制谷胱甘肽合成。
b) 使用GGsTop抑制γ-谷氨酰转肽酶（GGT）活性。
c) 使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为抗氧化剂降低ROS水平。

体内异种移植研究
将对照或GCLC沉默的淋巴瘤细胞皮下接种到NOD-SCID免疫缺陷小鼠中，以评估谷胱甘肽产生对体内肿瘤生长的影响。

结果
3D凝胶选择性地支持部分淋巴肿瘤细胞的存活
流式细胞术分析细胞周期分布和活力表明，在3D凝胶中培养细胞会导致非肿瘤淋巴样细胞（PBLs和LCLs）迅速凋亡，40-50%的细胞在24小时内发生凋亡。相比之下，淋巴瘤细胞（DG-75和BL-2）表现出更强的抗性，24小时后凋亡细胞比例<20%。


使用FSC/SSC分析和钙黄绿素-AM染色进行的细胞活力评估证实了这些发现，显示非肿瘤细胞和一部分肿瘤细胞在3D凝胶中培养24-48小时后活力显著降低。

氧化应激在3D凝胶中诱导细胞死亡
对DCFDA染色细胞的流式细胞术分析显示，在3D凝胶中培养会导致所有测试细胞类型中的细胞内ROS水平急剧增加。


使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理显著降低了ROS水平，提高了细胞活力，并促进了3D凝胶中肿瘤和非肿瘤淋巴样细胞的生长。

谷胱甘肽是淋巴肿瘤细胞在3D凝胶和异种移植物中生长所必需的
对mBCl染色细胞的流式细胞术分析显示，当在3D凝胶中培养24小时时，淋巴肿瘤细胞而非LCLs表现出增加的还原型谷胱甘肽水平。使用BSO药理学抑制谷胱甘肽合成显著降低了谷胱甘肽水平，增加了ROS积累，并阻断了淋巴肿瘤细胞在3D凝胶中的菌落形成。

使用shRNA沉默GCLC进一步证实了谷胱甘肽在TIC样细胞存活和生长中的关键作用。流式细胞术分析表明，GCLC敲低显著降低了3D凝胶中的谷胱甘肽水平和细胞活力，而不影响2D培养中的活力。重要的是，GCLC沉默还显著抑制了异种移植模型中的体内肿瘤生长。

淋巴瘤/白血病患者肿瘤细胞中的谷胱甘肽和ROS失调
对B细胞淋巴瘤/白血病患者原代细胞的分析显示，与健康捐赠者的非肿瘤B细胞相比，患者细胞具有更高的细胞内谷胱甘肽水平和更低的ROS水平。

关键流式细胞术发现总结


总之，本研究利用流式细胞术作为有力工具，阐明了淋巴瘤起始细胞在3D凝胶中选择性存活和生长的分子机制。结果强调了谷胱甘肽过度产生在介导TIC存活中的关键作用，并提示靶向谷胱甘肽合成可能是淋巴瘤/白血病患者的一种有前途的治疗策略，特别是对于女性患者。这些发现强调了在开发新型癌症疗法时考虑肿瘤微环境和氧化应激反应的重要性。

参考文献：H.-Alcántara, A., Kourani, O., Marcos-Jiménez, A. et al. Glutathione overproduction mediates lymphoma initiating cells survival and has a sex-dependent effect on lymphomagenesis. Cell Death Dis 15, 534 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06923-z