是什么使中性粒细胞变懒惰？

niwanmao

中性粒细胞在先天免疫系统中起着至关重要的作用，作为对感染和炎症部位的第一反应者。最近的研究表明，成熟的中性粒细胞展现出比先前认为的更大的功能可塑性，包括组织依赖性的转录和代谢适应。尽管中性粒细胞是银屑病中炎性浸润的关键组成部分，但它们在疾病发病机制中的确切作用仍不清楚。

Uchańska, A.等人探讨了酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1）在中性粒细胞功能和趋化性中的作用。DGAT1是一种参与甘油三酯合成的酶。DGAT1在中性粒细胞中高表达，并催化甘油三酯形成的最后一步，甘油三酯是主要的能量储存形式。此外，DGAT1还将视黄酸转化为视黄醇酯，从而调节类维生素A的稳态。研究人员假设DGAT1通过控制甘油三酯和视黄酸的生物利用度来调节中性粒细胞的代谢和活性。为了验证这一点，他们利用银屑病小鼠模型来研究DGAT1缺乏如何影响慢性皮肤炎症期间的中性粒细胞浸润和功能。

材料与方法
流式细胞术
简要步骤：
- 通过机械解离和酶消化制备皮肤、脾脏和骨髓组织的单细胞悬液。
- 通过眼眶后采血收集血液样本至含有EDTA的试管中。
- 使用商品化裂解缓冲液裂解红细胞。
- 将细胞重悬于含有2%热灭活FBS的RPMI1640培养基中。

方案：
- 活性染色：用Zombie Aqua固定性活力试剂盒孵育细胞以排除死细胞。
- 脂质滴染色：使用荧光染料BODIPY 493/503量化细胞内脂质滴。
- Fc受体阻断：用抗CD16/CD32抗体孵育细胞以防止非特异性结合。
- 表面标志物染色：使用荧光素抗体混合物，包括：CD45.2-APC/Cy7（泛白细胞标志物）、CD11b-eFluor450（髓系细胞标志物）、Ly6G-APC或Ly6G-BV711（中性粒细胞标志物）、c-Kit-PE/Cy7或c-Kit-APC/eF780（干细胞/前体细胞标志物）、针对特定细胞群体的其他标志物（例如，CD34、Sca-1、CD19、CD3）
- 固定：染色后用4%多聚甲醛固定细胞。
- 组织浸润分析：在类似银屑病的炎症期间，量化皮肤、血液和骨髓中的中性粒细胞比例。
- 脂质滴量化：测量在不同条件下中性粒细胞中BODIPY 493/503的荧光强度。
- 脂肪酸摄取测定：分析用油酸培养的中性粒细胞中的脂质滴形成。
- 趋化性测定：在transwell实验中量化迁移的中性粒细胞。

小鼠模型：
- 使用Dgat1敲除小鼠（B6.129S4-Dgat1tm1Far/J）和野生型对照小鼠。
- 通过局部应用咪喹莫特乳膏诱导类似银屑病的炎症。

中性粒细胞分离：
- 通过密度梯度离心分离血液中的中性粒细胞。
- 使用磁珠进行阴性选择以分离骨髓中的中性粒细胞。

免疫组织化学：
- 对中性粒细胞和皮肤切片进行Ly6G和脂质滴染色。
- 使用荧光显微镜捕获图像。

基因表达分析：
- 通过实时PCR分析视黄酸响应基因的表达。
- 使用公开可用的RNA-seq数据识别其他靶基因。

代谢测定：
- 使用Seahorse XF生物分析仪测量糖酵解速率。

结果
DGAT1缺乏减少了银屑病炎症中的中性粒细胞浸润
对咪喹莫特处理的野生型（WT）和Dgat1敲除（KO）小鼠皮肤样本的流式细胞术分析显示，在缺乏DGAT1的情况下，中性粒细胞浸润显著减少。研究人员观察到：
- 在咪喹莫特治疗3天和6天后，与野生型对照小鼠相比，Dgat1KO小鼠皮肤中CD45+ CD11b+ Ly6G+中性粒细胞的比例显著降低。
- 在血液或骨髓中，WT和Dgat1KO小鼠之间的中性粒细胞比例没有显著差异，这表明皮肤浸润的减少不是由于系统性中性粒细胞缺乏。
- 这些发现得到了皮肤切片免疫组织化学的进一步支持，Dgat1KO小鼠中Ly6G+细胞数量较少。


DGAT1不影响中性粒细胞的脂质滴形成
为了研究中性粒细胞浸润受损是否由于脂质代谢改变，研究人员使用流式细胞术检查了脂质滴的形成：
- 基础脂质滴含量：在稳态下，WT和Dgat1KO中性粒细胞之间的BODIPY 493/503荧光强度没有显著差异。
- 脂肪酸摄取：当与油酸一起培养时，WT和Dgat1KO中性粒细胞均显示出BODIPY 493/503荧光的相似增加，表明脂质滴形成相当。

这些结果表明，DGAT1缺乏症不会损害中性粒细胞形成脂质滴或摄取脂肪酸的能力。

DGAT1缺乏不改变中性粒细胞的能量代谢
研究人员假设中性粒细胞浸润减少可能是由于能量产生受损。然而，基于流式细胞术的代谢测定显示：
- 使用Seahorse XF生物分析仪测量的细胞外酸化率（ECAR）表明，WT和Dgat1KO中性粒细胞之间的糖酵解速率没有显著差异。
- 在趋化性测定中，WT和Dgat1KO中性粒细胞对糖酵解抑制剂（2-脱氧葡萄糖）和线粒体呼吸抑制剂（鱼藤酮和抗霉素A）的敏感性相似。

这些发现表明，DGAT1缺乏症不会显著改变中性粒细胞的能量代谢。

DGAT1缺乏的中性粒细胞趋化性受损
为了直接评估中性粒细胞的趋化能力，研究人员进行了transwell迁移测定：
- Dgat1KO中性粒细胞向白三烯B4（LTB4）的迁移显著减少，与WT中性粒细胞相比。
- Dgat1KO中性粒细胞对来自咪喹莫特处理小鼠的皮肤提取物的趋化反应也受损。
- 流式细胞术分析显示，WT和Dgat1KO中性粒细胞之间LTB4受体（LTB4R1）的表达没有显著差异。

这些结果表明，Dgat1KO小鼠中中性粒细胞浸润的减少是由于趋化性本身的内在缺陷，而不是趋化因子受体表达的改变。

DGAT1缺乏的中性粒细胞中视黄酸响应基因上调
鉴于DGAT1在视黄酸代谢中的作用，研究人员调查了改变的视黄酸信号传导是否可能解释趋化性缺陷：
- 骨髓中性粒细胞前体的流式细胞术分析显示，WT和Dgat1KO小鼠之间它们的比例没有显著差异。
- RT-qPCR分析显示，与WT对照相比，Dgat1KO中性粒细胞中几种视黄酸响应基因（如Bst1、Ptafr和Fgr）上调。
- 用外源性全反式视黄酸（atRA）处理WT中性粒细胞模拟了Dgat1KO中性粒细胞中观察到的趋化性缺陷。

这些发现表明，DGAT1缺乏导致中性粒细胞中趋化性受损可能由增加的视黄酸信号传导介导。

综合上述结果，研究揭示了DGAT1在调节中性粒细胞趋化性中的重要作用，是通过影响视黄酸代谢来实现的。尽管DGAT1缺乏症不影响中性粒细胞的脂质滴形成或能量代谢，但显著损害了中性粒细胞趋化能力，使其变「懒惰」，从而在类似银屑病的炎症中减少了皮肤浸润。


下表是关键流式细胞术结果总结


n.s. = 不显著；MFI = 平均荧光强度；ECAR = 细胞外酸化率




参考文献：Uchańska, A., Morytko, A., Kwiecień, K. et al. Lazy neutrophils – a lack of DGAT1 reduces the chemotactic activity of mouse neutrophils. Inflamm. Res. (2024). https://doi.org/10.1007/s00011-024-01920-6