一种关键病毒基因，就能影响牛体内CD8+T细胞，导致致命淋巴增殖性疾病

niwanmao

牛羚伽马疱疹病毒1型（AlHV-1）是病毒与其天然宿主牛羚共同进化的典型代表。该病毒在牛羚体内不引起明显症状，但当传播至牛和其他易感反刍动物时，会导致一种称为恶性卡他热（MCF）的致命淋巴增殖性疾病。MCF与外周T细胞淋巴瘤（PTCL）相似，对牛羚和牛共存区域的家畜构成严重威胁。

先前研究表明，AlHV-1能够感染并持续存在于CD8+ T淋巴细胞中，而病毒基因组的维持对MCF的发展起着关键作用。然而，导致T细胞功能失调和淋巴瘤形成的具体机制仍不清楚。在Gong M等人2024年7月1日被PNAS接收的文章中，综合运用免疫学、基因组学和病毒学的先进技术，揭示了导致这种致命淋巴增殖性疾病的病毒与宿主之间的复杂相互作用。

文中用的流式方法

研究人员采用多维度的研究策略来探究AlHV-1诱导的淋巴瘤发生机制，其中流式细胞术在分析细胞表型和反应中发挥了关键作用。

外周血单个核细胞（PBMCs）的分离：
在感染AlHV-1野生型（WT）、ORF73缺陷型（73DEL）病毒或假感染后的不同时间点采集小牛血液样本。采用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离PBMCs。

细胞表面标记物染色：
分离的PBMCs用含1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%叠氮化钠的PBS洗涤。随后，细胞与荧光素偶联的抗牛CD3、CD4、CD8和CD21抗体在4°C下避光孵育30分钟。使用的抗体克隆如下：
- 抗CD3：MM1A（IgG1）
- 抗CD4：IL-A11（IgG2a）
- 抗CD8：BAQ111A（IgM）
- 抗CD21：BAQ15A（IgM）

细胞内染色：
为检测细胞内蛋白，首先按上述方法进行细胞表面染色，然后使用eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套装按照制造商说明进行固定和破膜。随后，用针对细胞内靶标（如Ki-67、颗粒酶A和TOX2）的抗体进行染色。

EdU掺入实验：
为评估细胞增殖，在采血前24小时向小牛静脉注射5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。按上述方法分离PBMCs并进行表面染色。使用Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒按照制造商协议检测EdU掺入。

细胞分选：
使用荧光激活细胞分选（FACS）技术纯化CD8+ T细胞，用于RNA测序（RNA-seq）、ATAC测序（ATAC-seq）下游分析。



结果
1、ORF73缺失的AlHV-1毒株致病性减弱并具有保护作用:

接种ORF73缺失(73DEL)AlHV-1毒株的牛犊未发展为MCF，并能抵抗后续野生型病毒的感染。

研究人员将AlHV-1野生型病毒、73DEL病毒(105 PFU,鼻内接种,n=4)或模拟接种物(Mock)接种牛犊,并监测恶性牛传染性发热(MCF)的临床症状。在感染后第46天,Mock组和73DEL组的牛犊再次接种AlHV-1野生型病毒(105 PFU,鼻内给药)用于攻击。在整个实验过程中,每周通过流式细胞术分析外周血单个核细胞(PBMC)中CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和CD21+ B淋巴细胞的比例,数据绘制于每头牛犊的图中。虚线框表示攻击阶段。



2、MCF过程中CD8+ T细胞的寡克隆扩增:

纯化的CD8+ T细胞的T细胞受体(TCR)测序表明，发展为MCF的牛犊的TCR多样性显著降低。这体现在优势克隆比例增加以及各种多样性指数下降。重要的是，这种寡克隆扩增在每头牛犊中都是独特的，提示AlHV-1驱动感染的T细胞克隆增殖，而非诱导一种共同的抗原特异性应答。

3、CD8+ T细胞的转录重编程:

分选的CD8+ T细胞的RNA测序揭示了MCF过程中基因表达的巨大变化。主要发现包括:
- 与细胞活化和增殖相关基因(如IRF8、MKI67)上调
- 细胞毒分子(如GZMA、GZMK)表达增加
- 耗竭相关基因(如PDCD1、CTLA4、TOX2)诱导
- 初始T细胞标志物(如CCR7、TCF7)下调

基因集富集分析(GSEA)进一步强调了干扰素应答、代谢、细胞分裂和TCR信号通路在MCF中发生显著改变。

4、CD8+ T细胞的染色质重塑:
ATAC-seq分析揭示了MCF过程中染色质可及性的实质性变化，鉴定出20000多个差异可及区域。其中许多区域与T细胞活化、耗竭和效应功能相关基因有关。基序富集分析提示转录因子如BATF、IRF4和NFAT在MCF样本中活性增加。

5、关键病毒因子的鉴定:
研究人员鉴定出一个病毒基因A10，编码一个含有多个酪氨酸残基以及预测的ITAM和SH3基序的跨膜信号蛋白。与A10相关的主要发现包括:
- A10表达对病毒在体外复制非必需，但对体内诱导MCF至关重要。
- A10在T淋巴细胞中被磷酸化，影响T细胞信号。
- A10的酪氨酸残基突变使病毒丧失诱导MCF的能力，并能防御野生型病毒感染。

表1:AlHV-1诱导的MCF过程中CD8+ T细胞的关键特征



参考文献：Gong M, Myster F, Azouz A, et al. Unraveling clonal CD8 T cell expansion and identification of essential factors in γ-herpesvirus-induced lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(32):e2404536121. doi:10.1073/pnas.2404536121