PNAS新发现：小鼠腹腔有两群不同的巨噬细胞SPMs和LPMs

niwanmao

腹腔长期以来一直是免疫学研究中获取巨噬细胞的首选来源。然而，尽管腹腔巨噬细胞在功能研究中得到了广泛应用，但它们的潜在异质性却很少被深入探讨。在一项发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上的开创性研究中，Bou Ghosn 等人开始研究小鼠腹腔内驻留的免疫细胞的组成和特征，深入研究了两种不同腹腔巨噬细胞的表型、功能和发育特征。

材料与方法
流式细胞术分析
1、样本制备：通过使用冷PBS对成年BALB/c小鼠进行腹腔冲洗，收集腹腔细胞。将所得的单细胞悬液进行制备并用于流式细胞术分析。

2、多色方案，能够在每个细胞上区分多达11个标志物。包括但不限于：
- CD11b（克隆M1/70）
- F4/80（克隆BM8）
- CD19（克隆1D3）
- Gr-1（克隆RB6-8C5）
- MHC-II（I-A/I-E，克隆M5/114.15.2）
- CD11c（克隆HL3和N418）
- TLR4（克隆MTS510）

功能性检测方法
1、体内吞噬实验：将表达GFP的大肠杆菌腹腔注射到小鼠体内。2小时后，收集腹腔细胞，染色后通过流式细胞术分析细菌的摄取情况。

2、一氧化氮（NO）生成：使用荧光指示剂DAF-FM二乙酸酯测量细胞内NO含量。细胞在体内或体外用LPS刺激后进行分析。

3、共聚焦显微镜观察：对分选后的GFP阳性巨噬细胞进行成像，使用Leica SP2共聚焦显微镜确认细菌的内化。

结果
1、两种不同巨噬细胞亚群：

a) 大型腹膜巨噬细胞（LPMs）：
- 在未刺激条件下，占腹膜巨噬细胞的约90%
- 体积较大（通过流式细胞术散射图和显微镜确定）
- 高表达CD11b和F4/80
- Gr-1和AA4.1阳性
- 不表达MHC-II

b) 小型腹膜巨噬细胞（SPMs）：
- 在静息状态下，占腹膜巨噬细胞的约10%
- 与LPMs相比，体积较小
- 低表达CD11b和F4/80
- Gr-1和AA4.1阴性
- 高表达MHC-II

表1：腹膜巨噬细胞亚群的关键表面标志物表达

(+++ 高表达, ++ 中等表达, + 低表达, - 阴性表达)



2、对刺激的差异性反应：

在体内使用脂多糖（LPS）或巯基乙酸刺激后：
- LPMs迅速从腹腔中消失
- SPMs在2-4天内成为主要的巨噬细胞亚群

3、不同的功能特征：

a) 吞噬作用：
- SPMs和LPMs均表现出体内吞噬GFP标记的大肠杆菌的能力。然而，SPMs的细菌负载（GFP荧光）较LPMs更高。

b) 一氧化氮（NO）产生：
- 体外：LPS刺激诱导LPMs产生NO，但不诱导SPMs产生
- 体内：两种亚群均对LPS产生NO，但SPMs的产量更高

4、发育独立性：
- 研究表明，SPMs并非源自LPMs。相反，SPMs似乎起源于在刺激后迅速进入腹腔的血液单核细胞。

5、独特的基因表达谱：
- 微阵列分析揭示了SPMs和LPMs之间显著的基因表达差异，进一步支持了它们的独特身份。

6、在多种小鼠品系中的存在：
- SPMs和LPMs均在多种小鼠品系（BALB/c, C57BL/6, 129/S6, FVB/N, SJL/J, 和RAG-/-）中被鉴定出，表明这些亚群在进化上具有保守性。

7、与树突状细胞和单核细胞的区别：
- SPMs和LPMs在体积、表面标志物表达和定位上均不同于腹膜树突状细胞和血液单核细胞。

8、动态群体变化：

在使用高剂量的LPS（≥10 μg）刺激后，观察到巨噬细胞亚群组成发生显著变化：
- 刺激后第2天，SPMs成为主要的腹膜巨噬细胞亚群
- LPMs的频率下降到总腹膜巨噬细胞的不到10%


SPMs和LPMs的发现为理解腹腔巨噬细胞生物学提供了一个新的框架，并为探讨巨噬细胞在稳态和疾病中的功能开辟了新的研究途径。


参考文献：Ghosn EE, Cassado AA, Govoni GR, et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(6):2568-2573. doi:10.1073/pnas.0915000107