胸腺Treg发育中被忽视的关键分子，你知道吗？

niwanmao

调节性T细胞（Tregs）在维持免疫耐受和预防自身免疫性疾病中起着至关重要的作用。这类特殊的CD4+ T细胞以其表达转录因子Foxp3和IL-2受体α链CD25为特征，主要在胸腺中通过复杂的过程发育而来。近期研究发现，有两种不同的前体细胞群体可分化为成熟的Tregs：CD25+Foxp3-前体细胞和CD25-Foxp3lo前体细胞。尽管CD25+前体细胞的发育路径已经被深入研究，但调控新发现的Foxp3lo前体细胞发育途径的机制仍然不清楚。

在本研究中，Borelli等人探讨了淋巴毒素（一种肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员）在胸腺Treg发育中的作用。他们研究了膜结合的淋巴毒素α1β2（LTα1β2）异构复合物如何调控Foxp3lo前体细胞向Tregs的成熟。研究人员假设，尽管LTα1β2在外周Tregs中已知会表达，但也可能在胸腺Tregs发育过程中会被诱导，并对这一过程产生影响。通过阐明调控这一新发现的发育途径的机制，可加深对Treg生成的理解，并有望发现调节免疫耐受的新治疗靶点。

材料与方法

小鼠品系与细胞制备：

本研究使用了几种转基因小鼠品系，包括：
- Rag2GFP x Foxp3Thy1.1小鼠：在Rag2启动子下表达GFP，在Foxp3启动子下表达Thy1.1
- Foxp3eGFP小鼠：在Foxp3启动子下表达增强型GFP
- Lta-/- 小鼠：淋巴毒素α缺陷小鼠
- Cd28-/-, Il2-/-, 和 Il15-/- 小鼠：分别缺乏CD28、IL-2和IL-15

在不同年龄段的小鼠（3天、6周、4个月）中收集胸腺。通过将胸腺轻轻通过70 μm细胞滤器过滤，制备单细胞悬液。使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。

抗体染色方案：
- CD4 (APC-H7)
- CD8 (BV510)
- CD25 (PE)
- CCR6 (PE-Cy7)
- H2-Kb (PE-Cy7)
- Qa2 (PerCP-Cy5.5)
- CD69 (PE-CF594)
- CD24 (BV605)

对于胞内染色，细胞使用Foxp3/转录因子染色缓冲液套装（eBioscience）根据制造商的说明进行固定和破膜处理。然后用抗体对以下标志物进行染色：
- Foxp3（在Foxp3Thy1.1小鼠中通过Thy1.1-BV421检测，或在其他品系中直接使用抗Foxp3-AF647检测）
- Ki67 (BV421)
- Nur77 (PE)
- BIM (AF647)

LTα1β2检测：
1. 用可溶性LTβR-Fc融合蛋白孵育
2. 使用APC标记的抗人IgG Fc抗体检测


使用以下设门策略来分析Treg亚群：
1. 活细胞（基于前向/侧向散射和活力染料排除）
2. CD4+单阳性胸腺细胞（CD4+CD8-）
3. 新生成细胞（在Rag2GFP报告基因小鼠中Rag2GFP+）
4. Treg亚群：

• CD4+ Tconv：CD25-Foxp3-
• CD25+ TregP：CD25+Foxp3-
• Foxp3lo TregP：CD25-Foxp3lo
• 成熟Treg：CD25+Foxp3+
  

CCR6的表达用于进一步区分新生成的（CCR6-）和循环再生的（CCR6+）Tregs。

增殖和凋亡检测：
- 增殖通过Ki67染色评估
- 凋亡通过Annexin V染色和胞内BIM水平检测

体外刺激实验：

分选的Treg亚群在完全RPMI培养基中培养，并使用以下方法刺激：
- 孔板结合的抗CD3ε（克隆145-2C11），以不同浓度进行刺激
- 重组小鼠IL-2，以不同浓度进行刺激

细胞在培养24-48小时后通过流式细胞术进行分析。

结果

胸腺Treg发育过程中LTα1β2表达的增加

通过对Rag2GFP x Foxp3Thy1.1报告基因小鼠的流式细胞术分析发现，胸腺Treg发育过程中膜结合型LTα1β2的表达逐渐增加。传统的CD4+ T细胞（Tconv）表现出极低的LTα1β2表达，而CD25+和Foxp3lo Treg前体细胞（TregP）则表现出略高的表达水平。在成熟的CD25+Foxp3+ Tregs中观察到最高的表达水平。


有趣的是，LTα1β2的表达与其他在Treg发育中起重要作用的TNFR家族成员（如GITR和OX40）水平呈强相关性。在成熟的Treg群体中，LTα1β2的水平还与CD25和Foxp3的表达正相关。



TCR和CD28信号在Treg前体细胞中上调LTα1β2

为了探究调控LTα1β2上调的信号，研究人员考察了其与TCR信号的关系。研究发现，LTα1β2与Nur77（一种TCR信号强度的标志物）在TregP和成熟Treg群体中均呈正相关（下图a）。体外使用抗CD3ε抗体刺激后，LTα1β2在CD25+和Foxp3lo TregP中剂量依赖性地增加，而在成熟的Tregs中则没有变化（下图b）。



通过使用Cd28-/-小鼠，研究人员展示了CD28共刺激的重要性。这些小鼠中的所有Treg亚群比例减少，且LTα1β2、OX40和GITR的表达水平也较低。

IL-2进一步在成熟Tregs中上调LTα1β2

鉴于IL-2和IL-15在Treg成熟中的作用，研究人员使用细胞因子缺失小鼠研究了它们对LTα1β2表达的影响。Il15-/-小鼠中未见显著变化，而Il2-/-小鼠中的成熟Tregs中LTα1β2表达显著降低。体外刺激表明，IL-2以剂量依赖性方式特异性地在成熟Tregs中上调LTα1β2表达，而在TregP群体中则无此变化。


Lta缺失通过Foxp3lo前体途径增强Treg发育

为了评估淋巴毒素在Treg发育中的功能作用，研究人员分析了Foxp3eGFP x Lta-/-小鼠。令人瞩目的是，与对照组相比，这些小鼠显示出Foxp3lo TregP和成熟Tregs的比例和数量增加，而CD25+ TregP则无显著变化（图3a,b）。这种表型在新生（3日龄）和成年（6周龄和4月龄）小鼠中均有所体现（图3c,d）。


进一步的分析显示，Lta-/-小鼠中Treg群体的增加与Foxp3lo TregP和成熟Tregs中增殖增强（更高的Ki67+细胞）和凋亡减少（更低的Annexin V+细胞和BIM水平）相关（图3e-g）。


多参数流式细胞术分析和对Treg谱系的无监督聚类分析揭示了Lta-/-小鼠中亚群组成的显著变化（图3h-k）。尽管早期CD25+ TregP簇表现不足，但更成熟的Foxp3lo TregP（簇8）和成熟Treg亚群（簇9-10）显著增加。这种群体动态的转变表明，Lta缺失通过Foxp3lo前体途径促进了加速成熟。


[表1: 关键流式细胞术发现的总结]



本研究表明，在胸腺Treg发育过程中，淋巴毒素α1β2的表达逐渐增加，并在调控Foxp3lo前体途径中发挥了此前未被识别的作用。Lta缺失通过促进Foxp3lo前体的增殖、生存及加速成熟，增强了成熟Treg的生成。这些发现为胸腺Treg发育的复杂调控机制提供了新的见解，并可能对靶向免疫耐受的治疗策略具有重要意义。

参考文献：Borelli, A., Santamaria, J.C., Zamit, C. et al. Lymphotoxin limits Foxp3+ regulatory T cell development from Foxp3lo precursors via IL-4 signaling. Nat Commun 15, 6976 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51164-5