流式细胞仪的原始荧光信号处理是怎样的

1myourmrz

本人是做微流控芯片流式检测相关研究的学生，对流式的原理大致都清楚，但是对于从荧光传感器接收到的原始电压信号要怎么进行预处理，比如如何进行信号放大，信号的降噪等（这方面一点也不懂，看文献中的词汇），处理过的信号该怎么表示出来，画直方图，还有散点图之类的，这些数据用matlab或者是其他统计分析软件可以处理，还是必须写成流式的标准格式文件.fcs才能进一步分析。希望有了解此方面的老师前辈不吝赐教，如果有相关的书籍，文献，尤其是描述流式细胞仪光学信号处理方面的可以推荐就更是感激！

niwanmao

1.信号预处理：
a） 放大：
在流式细胞术中，放大通常有模拟和数字两种方式，现在模拟放大已经被放弃了，主要是数字放大，即对数字化信号应用数学缩放。

您可能会遇到的术语：
-PMT（光电倍增管）增益
-线性放大
-对数放大

b） 去噪：
这一步消除了信号中不必要的变化。常见方法包括：
-中值滤波：减少脉冲噪声
-Savitzky-Golay滤波：在保持峰值形状的同时平滑数据
-小波去噪：分解信号并去除噪声分量

2.信号表示：
预处理后，可以通过多种方式可视化数据：
a） 直方图：显示单个参数的分布
b） 散点图：显示二维分布
c） 密度图：显示二维空间中数据点的密度

3.数据处理软件：
如果仅仅是做微流控研究 ，直接用MATLAB进行信号处理和统计分析是可以的
如果希望推广到其它人也能使用，就需要流式细胞术标准（FCS）文件格式，FCS格式包含：
-表头：档案基本信息
-文本段：实验元数据
-数据段：实际测量值
要将处理后的数据转换为FCS格式，需要根据FCS规范对其进行结构化。


建议你后续：
1.学习基本的信号处理概念，重点是流式细胞术特有的概念，国外的流式书籍Flow Cytometry Today_ Everything You Need to Know about Flow Cytometry (2022)这本书很好。
2.使用MATLAB或其他选定的软件进行练习，从简单的信号处理任务开始。
3.找一些实例数据，进行不同可视化技术的实验。
4.研究FCS文件格式规范，并练习从处理后的数据创建有效的FCS文件。

1myourmrz

非常感谢倪老师，这就开始学习，现在了解的基础知识确实太少了，先补补习

JindongLi

你的问题太宽泛了，并且你不可能自己做一套流式系统的。
detector接收到荧光，产生电流信号，经过跨阻放大器变成电压信号，然后滤波，在经过AD变成数字信号，数字信号经过DSP滤波，然后firmware对信号进行识别，找到脉冲，计算峰值和面积，上报给上位机，上位机根据峰值或者面积的分布，汇出直方图，散点图和密度图。根据FCS文件格式的要求保存数据。

1myourmrz

JindongLi 发表于 2024-10-23 13:22
你的问题太宽泛了，并且你不可能自己做一套流式系统的。
detector接收到荧光，产生电流信号，经过跨阻放大 ...

非常感谢您的解答，这个流程很有帮助，我目前的工作重点就是从接收荧光信号到形成可供分析的数据这样一个过程，只收集单色荧光和前向散射光FCS。主要目的是在微流控芯片系统上实现流式细胞仪的功能，现在也有在测试的鞘液流芯片。看文献中鞘液流，或者其他单细胞聚焦这里描述还算是比较完整，而且也可以用显微镜辅助观察，但是对于信号转换，处理这里由于是外行，看不太懂，而且有哪些步骤都不是特别清楚，没有找到描写很详细的文献（可能没找对方向），目前是用APD采集到的信号，电压信号转化成二进制的数据格式，再利用MATLAB进行简单的数据处理，但问题就是细胞的荧光信号区分度很差，用8色荧光微球检测，只能测到明显的3个峰。
所以还想请教您两个问题：
1.关于流式信号采集、转换、处理的光电系统该怎样去查找相关文献或者详细介绍，这部分是不是各个厂商的专利，各不相同，个人很难去做到类似的
2.如果细胞或微球在检测点不是单细胞经过，对信号的影响大不大，或者有没有相对应的信号处理方式？（为了尽量减小非单细胞排列经过检测点，我们利用黏弹性溶液进行单细胞聚焦，测试了标准大小的微球（spherotech-Flow Cytometry Particle Size Standard Kit），能得到较好的FSC正态分布的信号，但是同一厂商（spherotech-Rainbow Calibration Particles）的8色彩虹微球就难以做到很好的区分，同样的样品也用BD FACSCalibur 进行了测试对比，BD测试结果没问题；

感谢您的时间解答

niwanmao

1myourmrz 发表于 2024-11-7 09:17
非常感谢您的解答，这个流程很有帮助，我目前的工作重点就是从接收荧光信号到形成可供分析的数据这样一个 ...

一般流式书籍上，通常不会去介绍硬件机理层面的内容，不知道那些光电系列的杂志上是否会能找的到？可搜搜看

经过检测点的时候，单细胞还是很关键的，目前的流式通过面积和高度（或宽度）确认是否多个信号粘连

1myourmrz

niwanmao 发表于 2024-11-7 11:05
一般流式书籍上，通常不会去介绍硬件机理层面的内容，不知道那些光电系列的杂志上是否会能找的到？可搜搜 ...

谢谢倪老师啊，我再找找相关理论支持，再根据每次的检测结果不断地调整

JindongLi

1myourmrz 发表于 2024-11-7 09:17
非常感谢您的解答，这个流程很有帮助，我目前的工作重点就是从接收荧光信号到形成可供分析的数据这样一个 ...

8峰球如果只看到3个峰，可能有几个原因，1.你的荧光或者FSC收集系统效率太低，2.你的信号放大系统放大倍数不够，或者你的噪声太高。这两个都是需要很有经验的工程师才能解决的问题。
你的2个问题：
1.建议你买先成的系统，thorlab之类的网站上面会有卖的，自己搭建的话，我不太清楚你的技术背景，还是需要一些工科基础的。
2.如果不是单细胞通过，这就取决你的光学系统的分辨率了，你得到的脉冲信号是细胞和光斑的卷积，如果你的光斑足够小还是可以分辨出两个粘连在一起的细胞（但也取决细胞如何粘连的）。你说的8色彩虹球没办法区分，是得不到8个峰，还是单个峰不是正态分布？把你彩虹球的直方图发一个出来看看。

1myourmrz

JindongLi 发表于 2024-11-8 07:27
8峰球如果只看到3个峰，可能有几个原因，1.你的荧光或者FSC收集系统效率太低，2.你的信号放大系统放大倍 ...

好的非常感谢指点迷津，如果能找到直接能用的流式光学模块就太好了，您说的这两个原因我们也去排查一下

niwanmao

1myourmrz 发表于 2024-11-13 13:54
好的非常感谢指点迷津，如果能找到直接能用的流式光学模块就太好了，您说的这两个原因我们也去排查一下
...

坐标没有用Log？