流式实验流程与设计问题，新手遇到了大难关！

WYLLQ

流式新手有好多问题请问一下大家！


实验目的：测HeLa细胞表面2种蛋白的表达情况（瞬时转染的质粒），
实验室仪器：贝克曼库尔特公司的CytoFLEX-S
处理数据软件：FlowJo（10.8.1）



我目前做流式需要双染两个抗体（一个兔抗AF488荧光，一个鼠抗PE荧光），现在也有两个抗体单染、双染以及PI单染的数据（抗体都做了Isotype control）。
可以接受流式实验全部重做，因为遇到了一个在流式上极其严格的review，如果不重做需要回复一个很立得住的原因。

1. 目前处理方式是通过PI单染来圈死亡细胞群（结果显示是在FSC偏左的那群），可以以此默认死亡细胞群的位置，不做两个抗体加PI的三染数据吗？


2. 实验设计改良：如果必须做三染，鼠抗带PE荧光的可以换成AF647荧光的，或者PI换成DAPI等别的试剂（7-AAD目前实验室没有）来确定死亡细胞，哪种方法调补偿得到的结果会更好？

3.PI或者DAPI在流式需要设Isotype control这样的阴性组吗？如果需要怎么设比较好？

4. Fc Human blocking已经添加了，聊这个话题的时候师兄说也可以加鼠血清和兔血清代替BSA（根据抗体的种属），Fc human blocking与血清的作用应该不一样，但我不确定血清的作用是什么，我的实验是否需要添加？

5.之前做流式是跟据实验室的一些笔记操作的， 官方推荐抗体原液5 uL/test，但是课题组用的是1 uL/test（非抗体滴定的结果），我的流式数据已经出来了，需要补抗体滴定结果吗？或者全部重做一遍？

6. 可以求一些推荐的流式学习资源吗？自己看不太出来哪些资源更好

感谢各位！！！！

macxuao

说一下我的建议哈，权当参考，一般咱们染死活的话最好还是共染，这样圈出来的活细胞才有说服力，单纯按照死细胞位置去圈的话可能会漏掉一些死细胞，这个实验里的荧光组合PI  7-AAD 可能与PE  AF647的干扰都挺大的，如果机器能测DAPI的话，建议用DAPI更好，或者换成各类荧光标记的胺类死活染料，和PE  AF647错开荧光就好。死活染料的阴性对照用空白对照即可，但死活染料如果用的浓度较高时本底会比较高，咱们判定死活也就默认强阳的是死细胞 ，阴性或弱阳的是活细胞。关于封闭，Fc Block试剂肯定是最好的，血清也是起到封闭的作用，加了FC Block的话，就不用再加血清封闭了，不过细胞洗液PBS里咱们一般会加FBS或者BSA。关于抗体用量，能提前做一下滴定那肯定是最好的，如果没做的话，实验里最好做上同型对照管，以判定非特异性结合和本底染色，如果问到抗体用量是否合适的问题时，有同型对照就可以说明，因为同型对照的用量和特异性抗体的用量是相同的。

WYLLQ

macxuao 发表于 2024-9-11 18:43
说一下我的建议哈，权当参考，一般咱们染死活的话最好还是共染，这样圈出来的活细胞才有说服力，单纯按照死 ...

感激！！！谢谢您的解答！

司徒随风

死活对照样本一般为死细胞，证明死活染色没有问题，因为死活是取阴性细胞，对照为阳性；Fc human blocking与血清在这里都是作为封闭剂使用，Fc human blocking更纯一点，一般流式这个用的多，不按推荐来的话最好做一下滴定，不然别人质疑的话你没有充分的理由。

WYLLQ

司徒随风 发表于 2024-9-12 13:08
死活对照样本一般为死细胞，证明死活染色没有问题，因为死活是取阴性细胞，对照为阳性；Fc human blocking ...

感谢🙏！